桂皮醛对关节炎大鼠JAK/STAT信号通路的作用机制研究①

武豪杰 张明辉 洪成智 李 遵 陈欣欣（河南大学淮河医院骨科，开封475001）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种全身慢性自身免疫性疾病，以滑膜炎、组织增生、血管翳形成和骨质损伤为典型特征，患者常有关节肿胀、疼痛、功能障碍甚至关节畸形等［1］。该病发病率及致残率高，严重影响患者的生存质量，临床治疗以药物、外科治疗、免疫和生物疗法为主，往往给患者带来沉重的经济负担［2］。肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）是我国传统中药材，具有广泛的药理作用，也是一种常用的食品调味剂［3］。桂皮醛（Cinnamaldehyde，Cin）是肉桂的主要有效成分，多项研究证实Cin对RA具有治疗作用，但具体机制尚不清楚［4-6］。近年来，有研究报道JAK∕STAT信号通路的激活与关节炎多细胞因子水平升高相关，在关节炎的发病过程中起重要作用［7］。因此，本研究以JAK∕STAT信号通路为切入点，采用IL-1β诱导的MH7A人RA成纤维样滑膜细胞和Ⅱ型胶原诱导的大鼠关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型，探究Cin对MH7A和CIA大鼠的作用及其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人RA成纤维样滑膜细胞MH7A，购自上海中科院细胞库。细胞采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.1.2 动物SPF级SD大鼠40只，6周龄，体重180～220 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2017-0011）。实验动物及饲养条件符合《实验动物管理条件》要求。

1.1.3 药品与试剂 桂皮醛（纯度＞98%）购自上海一基实业有限公司；弗氏完全佐剂、牛Ⅱ型胶原蛋白购自碧云天生物技术有限公司；甲氨蝶呤（MTX，2.5 mg×100片）购自上海上药信谊药厂有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清、青链霉素混合液（100×）、胰蛋白酶-EDTA消化液、HE染色试剂盒、CCK-8试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、脱脂奶粉、ECL发光液、PVDF转印膜购自北京索莱宝科技有限公司；IL-6、IL-8、TNF-α ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH兔源单克隆抗体、羊抗兔二抗购自美国CST公司；Marker购自SMOBiO公司；中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 仪器AE223电子天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；By-dzc3000大鼠豚鼠专用电子秤购自北京宝元兴业科技有限公司；37140爪肿测量仪购自意大利Ugo Basile；MET VX200-T型涡旋振荡器购自施锐（上海）贸易有限公司；DW-86L626超低温冰箱购自海尔公司；YA.ZD-10普通型电热蒸馏水器购自上海申安医疗器械厂；RM2245切片机购自上海聚慕医疗器械有限公司；DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪购自北京六一仪器厂；G：BOX多功能凝胶成像系统购自Syngene；Multiskan MK3酶标仪购自Thermo Fisher Scientific；IX53显微镜购自日本奥林巴斯；TGL16MB高速冷冻离心机购自长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养MH7A细胞接种在含有10%胎牛血清RPMI1640培养基，在5%CO2、37℃、饱和湿度细胞培养箱中培养。当细胞生长至覆盖培养皿70%～80%时，PBS清洗2次，胰酶消化液处理1 min，用含血清的1640培养基终止消化，1∶3传代。

1.2.2 CCK-8检测不同浓度Cin对MH7A细胞活性的影响 将MH7A细胞以5×103个∕孔的浓度接种在96孔板中，每孔100 μl，置于培养箱中培养24 h，细胞贴壁后弃掉培养基，加入含Cin终浓度分别为0、20、40、60、80、100 nnol∕L的培养基90 μl，每组设置6个复孔，置培养箱中培养24 h，然后加入10 μl CCK-8在37℃下继续孵育2 h，450 nm处测吸光度，实验重复3次。

1.2.3 ELISA试剂盒检测MH7A细胞IL-6、IL-8、TNF-α的含量 将MH7A细胞以5×106个∕孔的浓度接种于6孔板中，细胞过夜贴壁后进行实验。细胞分为对照组、IL-1β组、IL-1β+Cin组。对照组加入2 ml正常培养基，IL-1β组加入2 ml含20 ng∕ml IL-1β的培养基，IL-1β+Cin组加入2 ml含有20 ng∕ml IL-1β和不同浓度Cin（40、60、80 nnol∕L）的培养基，以上各组细胞放置在5%CO2、37℃的培养箱中培养，24 h后收集细胞和其培养上清。细胞用于Western blot法检测蛋白表达，细胞培养上清用于检测细胞因子含量。取各组待测细胞培养上清加入到反应孔中，每孔100 μl，每组分别设4个复孔，37℃孵育90 min，弃掉孔内液体，加入100 μl生物素化抗体工作液，37℃孵育60 min，弃掉孔内液体，洗涤3次，随后加入100 μl酶结合物工作液，37℃孵育30 min后弃掉孔内液体，洗涤5次，每孔加入90 μl底物溶液，37℃孵育15 min，加50 μl终止液，450 nm波长下检测，按照标准曲线计算各组细胞培养上清中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

1.2.4 Western blot法检测细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表达 取1.2.3中收集的各组细胞，加入蛋白裂解液置冰上裂解20 min，离心取上清，测定蛋白的浓度，配制15%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，上样后80 V电泳2 h，60 V转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，随后将条带放入10 ml的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3兔源一抗蛋白稀释液中，一抗稀释比例为1∶500，4℃过夜，第2天用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min。37℃环境下加入羊抗兔二抗孵育2 h，二抗稀释比例为1∶1 000，TBST缓冲液清洗3次后滴加ECL发光液，反应1 min后置于凝胶成像系统显影。免疫印迹实验的内参蛋白为GAPDH，用Image J软件分析各个蛋白对应的灰度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值∕内参蛋白灰度值。

1.2.5 Ⅱ型胶原诱导的大鼠CIA模型的制备 从40只大鼠中随机选取30只造CIA模型，另外10只大鼠为对照组。将Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂混合均匀，乳化，制成1 g∕L的乳剂，按照0.1 ml∕只的剂量在造模大鼠尾根部皮下注射，7 d后再进行1次加强注射，对照组以同样的方法在相同部位注射等量生理盐水，造模时间共计14 d［8］。CIA模型的成功与否以关节炎评分（arthritis index，AI）进行判断。采用4分制标准进行AI评分：0分为各足跖未见肿胀；1分为足跖轻度肿胀；2分为足跖中度肿胀；3分为足跖部位重度肿胀；4分为足跖部和踝关节部均肿胀或呈畸形。将前后四足累计评分作为AI评分，评分为4分以上的大鼠认定为造模成功，最大评分为16分［9］。

1.2.6 分组及给药 取造模成功的大鼠根据体重随机分为模型组、Cin组（75 mg∕kg）、甲氨蝶呤组（MTX，1 mg∕kg），每组10只，给药方法为灌胃给药，给药体积为10 ml∕kg。模型组和对照组大鼠灌胃给予等量蒸馏水。于造模成功后第2天开始给药，1次∕d，连续21 d［1］。

1.2.7 测量大鼠AI评分和足跖容积 分别在造模第14、21、28、35天时，记录AI评分；在大鼠踝关节处做标记，在造模前、造模第14、21、28、35天时采用爪肿测量仪测量大鼠左后足跖容积［10］。

1.2.8 ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的水平 给药21 d后结束实验，大鼠麻醉后腹主动脉取血，放在4℃冰箱中静置2 h，3 000 r∕min离心10 min，分离血清。采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的水平，具体流程同1.2.3。

1.2.9 HE染色观察各组大鼠关节组织病理学改变 试验结束后，处死大鼠，分离其后肢踝关节，置于10%的福尔马林中固定，随后进行脱钙、组织脱水、制作组织蜡块、切片，切片厚度为4 μm。组织切片置于载玻片上，使用二甲苯脱蜡30 min，不同浓度梯度的乙醇溶液中复水，然后使用苏木精和伊红染液分别染细胞核和细胞质，脱水后用中性树胶封片，置于显微镜下观察各组大鼠关节组织的病理改变。

1.3 统计学分析 应用SPSS25.0软件对实验数据进行统计分析，GraphPad Prism 8.0作图。实验重复3次，计量资料以±s表示，多样本比较采用单因素方差分析，两样本比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法检测Cin对MH7A细胞活性的影响结 果 显 示：不 同 浓 度 的Cin（0、20、40、60、80、100 nmol∕L）对MH7A细胞活性的影响无显著差异（P＞0.05）。表明Cin在0～100 nmol∕L浓度范围内不影响MH7A细胞的活性。因此，课题组在随后的实验中选择40、60和80 nmol∕L剂量的Cin研究其对RA的潜在治疗作用，见图1。

图1 CCK-8法检测Cin对MH7A细胞活性的影响Fig.1 CCK-8 method to detect effect of Cin on activity of MH7A cells

2.2 各组MH7A细胞培养上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量 药物干预后24 h，与对照组比较，IL-1β组MH7A细胞培养上清中IL-6、IL-8、TNF-α含量升高，IL-1β+Cin组细胞培养上清中炎症因子的水平则显著降低，呈剂量依赖性（P＜0.05），说明Cin可抑制IL-1β诱导的MH7A细胞释放炎症因子，见表1。

表1 各组MH7A细胞培养上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量（±s，n=3）Tab.1 Contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in MH7A cell culture supernatant of each group（±s，n=3）

表1 各组MH7A细胞培养上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量（±s，n=3）Tab.1 Contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in MH7A cell culture supernatant of each group（±s，n=3）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs IL-1β group.

Groups Control IL-1β IL-1β+Cin-40 IL-1β+Cin-60 IL-1β+Cin-80 IL-6（ng∕ml）1.09±0.02 11.54±0.551）10.02±0.981）8.42±0.671）2）3.20±0.321）2）IL-8（ng∕ml）1.01±0.01 55.23±4.231）52.87±5.571）50.21±3.241）30.19±2.251）2）TNF-α（pg∕ml）3.94±0.12 14.89±0.911）13.23±0.861）12.01±1.021）2）7.65±0.841）2）

2.3 各 组MH7A细 胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达 药物干预后24 h，与对照组比较，IL-1β组MH7A细 胞 中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达水平显著增加（P＜0.05）；与IL-1β组 比 较，IL-1β+Cin组MH7A细 胞 中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达水平降低，Cin抑制了JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 Western blot检测各组MH7A细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达情况Fig.2 Protein expression levels of JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 in MH7A cells of each group were determined by Western blot

2.4 Cin对CIA大鼠AI和足跖肿胀度的影响 造模第14天，模型组、Cin组和MTX组大鼠后足出现明显红肿，体积增大，AI显著升高，说明造模成功。与模型组比较，给药后Cin组和MTX组大鼠AI指数和足跖容积均显著降低（P＜0.01），表明Cin和MTX可显著抑制CIA大鼠的足跖肿胀，降低AI评分，见表2。

表2 Cin对CIA大鼠AI评分和足跖容积的影响（±s，n=10）Tab.2 Effect of Cin on AI score and paw volume of CIA rats（±s，n=10）

表2 Cin对CIA大鼠AI评分和足跖容积的影响（±s，n=10）Tab.2 Effect of Cin on AI score and paw volume of CIA rats（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model Cin MTX AI score 14 d-9.53±1.21 9.51±1.33 9.49±1.02 21 d-9.96±1.23 8.51±1.192）8.49±1.062）28 d-10.11±1.18 7.02±1.072）7.31±1.252）35 d-11.15±1.24 7.21±1.062）7.33±1.192）Paw volume∕ml 0 d 1.73±0.09 1.73±0.08 1.72±0.09 1.73±0.08 14 d 1.74±0.09 2.38±0.131）2.26±0.121）2.30±0.111）21 d 1.74±0.08 2.48±0.111）2.23±0.121）2）2.29±0.091）2）28 d 1.74±0.10 2.97±0.121）2.09±0.111）2）2.18±0.111）2）35 d 1.75±0.09 3.37±0.121）2.01±0.091）2）2.07±0.081）2）

2.5 各组大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的水平 与对照组比较，模型组大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，Cin组和MTX组大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的表达水平均显著降低（P＜0.05），见图3。

图3 各组大鼠血清IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α含量比较Fig.3 Comparison of serum IL-6，IL-8，IL-1β and TNFα levels in rats in each group

2.6 Cin对CIA大鼠关节滑膜组织病理变化的影响 对照组大鼠关节组织病理切片可见清晰关节腔，无炎症细胞浸润，未见组织增生。与对照组比较，模型组大鼠关节组织病理切片可见滑膜细胞明显增生，组织间隙缩小，关节面明显粗糙且有大量炎症细胞浸润和血管新生；与模型组比较，Cin组大鼠给药治疗后组织增生明显减少，炎症细胞浸润的现象显著减轻；同样，MTX组也缓解了CIA大鼠的关节组织损伤和炎症反应，见图4。

图4 各组大鼠关节滑膜组织病理学观察（×100）Fig.4 Histopathological observation of joint synovium of rats in each group（×100）

3 讨论

RA属于自身免疫性疾病，临床表现以关节慢性炎症、疼痛肿胀、四肢运动障碍为主，严重者可导致关节畸形、丧失基本功能，使患者生存质量受到极大影响，是危及人类生命健康的主要疾病之一［11］。实验及临床研究证明，中药及其有效成分对RA的治疗效果显著，可多成分、多靶点影响RA的发生发展及转归［12-13］。桂皮醛是我国传统中药肉桂的主要活性成分，常被用作香料和食品添加剂。现代研究表明，肉桂具有抗菌、抗炎、抗肿瘤，治疗糖尿病和肥胖等代谢系统疾病的作用［14-15］。研究发现，桂皮醛可能对RA疾病具有一定的抑制作用，但其作用机制尚未明了［16］。本研究采用人滑膜成纤维细胞MH7A和Ⅱ型胶原诱导的大鼠关节炎模型研究桂皮醛对RA的作用，以探讨其作用机制。

RA的发生机制复杂，大量研究表明，滑膜成纤维细胞在RA疾病中具有重要作用，活化的滑膜成纤维细胞是滑膜组织中炎症介质和促炎因子的主要来源，而炎症因子的浓度往往与患者的临床症状、炎症指标、疾病活动和血清生物指标等密切相关，抑制炎症因子的水平则可显著降低滑膜细胞活化导致的骨侵蚀和关节破坏［17-18］。本研究结果显示，IL-1β诱导24 h后，IL-1β组MH7A细胞培养上清中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α含量显著升高，使用不同浓度的Cin处理后，MH7A细胞上清中IL-6、IL-8、TNF-α含量降低，表明Cin可抑制IL-1β诱导的炎症因子释放。与体外实验结果一致，在体内实验中，我们发现模型组大鼠后足明显红肿、体积增大，AI显著升高，血清中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表达水平亦显著升高，与模型组比较，Cin组大鼠AI指数和足跖容积均显著降低，血清炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的表达水平亦显著降低，表明Cin可减少关节炎大鼠炎症因子的分泌，改善大鼠AI指数，减轻关节肿胀程度。RA疾病的治疗中最重要的目标即通过预防骨质破坏来维持正常的关节功能［19］。本研究中，我们采用HE染色观察Cin对关节炎大鼠关节组织病理变化的影响，结果显示，模型组大鼠的关节组织切片可见明显滑膜组织增生，组织间隙缩小，关节面明显粗糙且有大量炎症细胞浸润现象，而Cin可显著减轻Ⅱ型胶原所致的关节组织炎症细胞浸润和骨质破坏，表明Cin能够改善关节炎大鼠关节组织病变，减轻关节损伤。JAK∕STAT信号通路是一种高度保守的信号转导途径，在机体的免疫调节和炎症过程中具有重要作用［20］。ZHU等［21］研究发现，JAK∕STAT信号通路关键蛋白的活化可促进RA过程中滑膜成纤维细胞增生、促炎细胞因子释放和骨质破坏。YANG等［22］研究证明，抑制JAK∕STAT信号通路活化使胶原诱导型关节炎大鼠的成纤维样滑膜细胞Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，细胞凋亡显著，抑制JAK∕STAT信号通路是目前治疗RA的一种潜在新途径。本研究Western blot检测结果显示，IL-1β的诱导可使MH7A细胞中JAK2和STAT3蛋白相对表达水平及其磷酸化水平升高，而不同浓度的Cin则降低了细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达水平，抑制JAK2和STAT3蛋白磷酸化程度，表明Cin可抑制JAK∕STAT信号通路的活化。

综上所述，Cin可能通过抑制JAK∕STAT信号通路活化，减少滑膜成纤维细胞释放炎症因子而产生的RA的治疗作用，可改善RA疾病的关节肿胀、炎症反应和骨质损伤现象。Cin可能是RA的潜在治疗药物。