PD-1阻断增强体外扩增的NK细胞对人非小细胞肺癌杀伤作用的研究①

王贺双 纪 军 吴园园 潘艳艳 高雁艳 杨 晋 孙晓彤 张 利

（大连市中心医院中心实验室，大连116033）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是临床上常见的呼吸道肿瘤疾病之一［1］。有研究报道显示，NSCLC的发病率约占肺癌的85%以上［2］。流行病学发现，NSCLC的发病率呈现逐年上升趋势，临床中主要表现为胸部胀痛、咳血、低热、疲乏、体重减轻等［3］。NK细胞属于大颗粒T淋巴细胞，同时也是人体免疫系统重要的效应细胞，在患者的肿瘤的入侵过程中，具有预先致敏效果［4］。在对患者的治疗中，用于免疫治疗的NK细胞主要来自患者的外周血。临床研究发现，异体NK细胞的输注治疗效果优于自体输注。抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）治疗已经在血液肿瘤系统的治疗中得到确认［5］。PD-1主要表达于患者抗原呈递细胞，对于患者的免疫系统的调控具有负性作用。在对NK细胞的扩增过程中，PD-1阻断增强作用，对于患者的治疗具有积极的意义［6］。本研究通过对PD-1阻断增强体外扩增的NK细胞对NSCLC杀伤作用的研究，为临床诊断提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料 本研究所采用的外周血单个核细胞主要来自健康人群的外周静脉血；NSCLC主要来自中国科学院的HCC827细胞。所有健康人群均签署知情同意书。将以上两种细胞接种于含有10%的胎牛血清的RPMI1640的培养基中，37℃，CO2培养箱孵育过夜，间隔1 d进行营养液更换。

1.2 方法

1.2.1 NK细胞的体外扩增90% NK培养液采用10%FBS、2 mmol∕L GlutaMAX、10 μg∕ml的青霉素进行混匀。将外周血单个核细胞置于离心管中，放入等量的Ficoll液体，形成明显的分离液体层。1 800 r∕min离心20 min，使用移液枪将分离层中间的白膜层取出，将白膜层放于其体积为3倍的PBS液体中，混匀，再次1 800 r∕min离心20 min，弃去上清液，使用PBS液体清洗，再次1 800 r∕min，离心20 min，取出对实验有影响的混杂血小板成分。将以上得到的细胞分别接种于6孔板中，分别在6孔板中加入PBS液体稀释的CD16抗体（5 μg∕ml）以及重组IL-2（500 U∕ml），温箱培育5 d，孵育温度设定为37℃，孵育第5天，采用台盼蓝进行染色，显微镜下进行计数，随后添加重组IL-2。从第6天开始，隔天进行计数，继续对其进行培养，第9天，根据细胞的数量，及时将以上培养细胞转移到T25培养瓶中继续培养，培养过程中添加重组IL-2，分别在培养过程中的0 d、14 d、21 d以及25 d采用流式细胞仪进行NK细胞纯度检测［7］。

1.2.2 NK细胞的PD-1阻断增强 分别将细胞加入离心管1、2、3中，向离心管2中加入5 μl PD-L1抗体，向离心管3中加入5 μl PD-L2抗体，混合均匀后，在4℃下静置30 min后，分别向离心管1～3中加入1%的PBS液体再次1 800 r∕min离心20 min。弃去上清液，分别向离心管2～3中加入5 μl抗鼠IgGPE抗体，混合均匀后，室温下静置30 min。再次向离心管1～3中加入PBS液体再次1 800 r∕min离心20 min。弃去上清液，加入1%的PBS液体500 μl，重悬细胞，采用流式细胞仪进行NK细胞纯度检测。

1.2.3 PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的杀伤作用 取HCC827细胞置于96孔板中，贴壁后，使用1.2.1培养10 d的PD-1阻断增强NK细胞以及未进行PD-1阻断增强NK细胞，浓度分别为0.25、0.5、1 μmol∕L（HCC821细胞与NK细胞的比例设定为1：5），分别培养24 h、48 h、96 h，培养结束后，去掉培养基后，使用酶标仪对HCC827细胞的抑制率进行分析。本研究中以PD-1阻断增强NK细胞培养的HCC827细胞作为观察组，以未进行PD-1阻断增强NK细胞培养的HCC827细胞作为对照组，以培养24 h、48 h、96 h的细胞分别作为观察组和对照组的凋亡组。（HCC827细胞与NK细胞的比例设定为1：5）HCC827细胞的生长抑制率=［1-（观察组吸光度值-观察组凋亡吸光度值）∕（对照组吸光度值-对照组凋亡吸光度值）］×100%［8］。

1.2.4 观察指标

1.2.4.1 PD-1阻断增强NK细胞毒性分析 分别对离心管1、2、3中的PD-L1以及PD-L2表达水平进行比较。PD-L1以及PD-L2表达水平采用流式细胞仪进行检测。

1.2.4.2 PD-1阻断增强NK细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平比较 分别对0.25、0.5、1 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平使用流式细胞仪进行检测。在实验过程中，NK细胞的纯度在80%以上，数量为1×106个。

1.2.4.3 不同浓度PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率比较 分别对0.25、0.5、1 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率进行比较。

1.3 统计学方法 数据均采用SPSS20.0软件进行分析。其中计量资料以±s表示，计数资料以［n（%）］表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1阻断增强NK细胞的细胞毒性分析 本研究中，通过对NK细胞的纯度进行分析，0、14、21及25 d NK细胞的 纯 度分别为（0.12±0.03）%、（25.33±4.11）%、（39.94±4.58）%、（79.85±6.97）%。通过对离心管1～3中的PD-L1以及PD-L2表达水平进行比较，以及对NK细胞的PD-1阻断增强作用，其PD-L1以及PD-L2表达水平显著下降，差异存在统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 PD-1阻断增强NK细胞的细胞毒性分析（±s，μg/ml）Tab.1 PD-1 blockade enhances cytotoxicity of NK cells（±s，μg/ml）

表1 PD-1阻断增强NK细胞的细胞毒性分析（±s，μg/ml）Tab.1 PD-1 blockade enhances cytotoxicity of NK cells（±s，μg/ml）

Groups TUBE1 TUBE2 TUBE3 F P PD-L1 2.55±0.23 0.15±0.16 1.26±0.29 12.632 0.000 PD-L2 2.69±0.52 1.51±0.51 0.26±0.29 13.069 0.000

2.2 PD-1阻断增强NK细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平比较 通过对不同浓度的PD-1阻断增强NK细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平比较，不同浓度PD-1阻断增强NK细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平之间的差异存在统计学意义（P＜0.05，表2）。通过分析，在0.5 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞的细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平达到高峰。

表2 PD-1阻断增强NK细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平比较（±s，%）Tab.2 PD-1 blockade enhances expression of granzyme B，perforin and CD107a in NK cells（±s，%）

表2 PD-1阻断增强NK细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平比较（±s，%）Tab.2 PD-1 blockade enhances expression of granzyme B，perforin and CD107a in NK cells（±s，%）

Groups 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1 μmol∕L F P Granzyme B 80.88±2.33 90.03±2.02 86.23±2.11 9.887 0.000 Perforin 86.27±2.72 94.22±1.84 89.32±2.12 5.998 0.000 CD107a 68.17±2.34 71.20±2.92 69.83±1.39 6.791 0.000

2.3 不同浓度PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率比较 如表3所示，通过不同浓度PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率比较，三组PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率之间的差异存在统计学意义，0.5 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率显著高于其他两组。

表3 不同浓度PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率比较（±s，%）Tab.3 Comparison of inhibition rate of NK cells on HCC827 cells by PD-1 blockade at different con⁃centrations（±s，%）

表3 不同浓度PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率比较（±s，%）Tab.3 Comparison of inhibition rate of NK cells on HCC827 cells by PD-1 blockade at different con⁃centrations（±s，%）

Groups 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1 μmol∕L F P Inhibition rate 40.20±2.91 80.91±3.23 60.77±1.13 11.033 0.000

3 讨论

NSCLC是临床较为常见的肺癌类型之一，在对肿瘤细胞的抑制性治疗中，NK细胞的含量在一定程度上反应机体的免疫功能以及对肿瘤细胞的杀伤作用。NK细胞的活性最早发现于19世纪70年代，随着医学的不断发展，人们对于NK细胞的生物学功能以及抗肿瘤作用的研究有了飞跃的发展，有研究报道显示NK细胞在免疫系统以及对抗恶性肿瘤中发挥重大作用［8］。NK细胞主要分布在外周血以及脾脏中，在患者遭遇病毒、细菌以及肿瘤侵入过程中，起到预先致敏作用［9-10］。近年来的研究显示，NK细胞的免疫记忆功能，也进一步增强机体的适用性免疫功能［11］。在以往的研究中，通过对抗PD-1的NK细胞治疗，已经在血液肿瘤细胞的治疗中得到证实。

通过对离心管1～3中的PD-L1以及PD-L2表达水平进行比较，PD-L1以及PD-L2表达水平显著下降，分析认为，PD-L1以及PD-L2作为PD-1的配体，其含量显著降低，提示，本研究采用的NK细胞的PD-1阻断增强作用显著成功。通过不同浓度PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率比较，不同浓度PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率之间的差异存在统计学意义，0.5 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞对HCC827细胞的抑制率显著高于其他两组，提示，0.5 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞与HCC827细胞充分接触后，降低PD-1、PD-L1以及PD-L2的连接性，T细胞的PD-L1以及PD-L2的活性显著性抑制，对于非小细胞肺癌肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制性作用。生理学研究发现，PD-1阳性的T细胞通常被认为是较为疲惫的效应细胞，在肿瘤患者中，通过与T细胞PD-L1连接［12-14］。通过对功能效应以及扩增指数的降低，进而在一定程度上增强患者肿瘤细胞的扩增。同时在对患者的治疗过程中，最为合适的NK细胞的治疗剂量尚未明确，之前的动物实验中，通过对动物的NK细胞的输注，尚未发现剂量依赖性的不良反应，而在治疗中，目前治疗剂量为108～109个∕kg，在正常情况下，PD-1、PD-L1以及PD-L2的相互作用可导致磷酸酶的活化从而抑制T细胞的受体信号的传导，以及对免疫应答的负性调节［15］。同时，PD-1、PD-L1以及PD-L2的连接性作用，还可以通过对亮氨酸的AFP的转录因子的上调作用，进而对T细胞的增殖以及细胞因子的分泌进行抑制。而通过对NK细胞的细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平的分析，在0.5 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞的细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达水平达到高峰。提示在PD-1阻断作用能显著提升对肿瘤细胞的脱颗粒以及溶细胞功能。范晓杰等［16］通过对三阴性乳腺癌患者的分析认为，对患者的PD-1阻断有望成为日后治疗的方向，与本研究相互印证。

但是本研究还存在一定的局限性，由于伦理学的限制，尚未进行人体试验，有望在日后的研究中进行。

综上所述，0.5 μmol∕L PD-1阻断增强NK细胞对小细胞肺癌的细胞阻断作用显著，其对肿瘤细胞的杀灭作用的机制主要与活化型受体的升高有关。