基于TCGA数据库观察血管生成素样蛋白1在肺癌细胞生物学行为中的作用机制①

王西勇 丁陈波 戴 玉 夏宏林（安徽医科大学附属宿州医院（宿州市立医院），宿州234000）

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位于所有肿瘤首位［1］。早期远处转移是肺癌高死亡率的主要原因，其原因为肺癌细胞迁移和侵袭促进肺癌肿瘤生长和转移［2］。血管生成素样蛋白1（angiopoietin-likeprotein1，ANGPTL1）是维持血管完整和稳定的重要因子，在肿瘤形成、血管生成和重塑过程中扮演重要角色［3-4］。目前临床已证明ANGPTL1在胃癌、乳腺癌等肿瘤中异常表达，且与肿瘤发生发展密切相关，但其在肺癌中的表达及其生物学特性尚未见报道［5-6］。本研究通过TCGA数据库分析ANGPTL1在肺癌和癌旁组织中的表达与其与预后的关系，同时构建过表达ANGPTL1的肺癌细胞系，观察其对肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株NCI-H292、NCI-H460、LTEP-A-2，人正常肺上皮细胞BEAS-2B购自美国菌种保藏中心ATCC；NCI-H460-ANGPTL1 mimic及阴性对照NCI-H460-NC质粒、Drp1、PGAM5、Bax和GAPDH引物由上海吉玛制药技术有限公司设计合成；DMEM∕F12培养基（D8900）、DMEM培养基（D777）、1640培养基（R6504）、L15培养基（L4386）购自Sigma；SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒（QPK-201）购自Toyobo；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（RG027）购自碧云天；Trizol reagent（9009）购自TaKa-Ra；Matrigel基质胶（356234）购自BD；MCO-15AC细胞培养箱购自SANYO；Ti-U∕Ti-s倒置荧光显微镜购自Nikon；R480实时荧光定量PCR仪购自Roche。

1.2 方法

1.2.1 数据来源 从生物信息数据库TCGA中的肿瘤大数据分析网站GEPIA中查询ANGPTL1在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达（癌旁组织52例，肺癌组织503例），同时分析肺癌患者中ANGPTL1高表达和低表达与预后的关系。

1.2.2 RT-PCR检测ANGPTL1 mRNA表达 收集人肺癌细胞株NCI-H292、NCI-H460、LTEP-A-2、正常肺上皮细胞BEAS-2B及稳转干扰细胞系NCI-H460-ANGPTL1 mimic和NCI-H460-NC，Trizol法 提 取 总RNA，反转录，以反转录得到的cDNA为模板进行RTPCR检测，检测ANGPTL1 mRNA在多种人肺癌细胞中的表达，以GAPDH为内参，各样本重复实验3次。

1.2.3 MTT和EdU检测细胞增殖 将肺癌NCIH460、NCI-H460-ANGPTL1 mimic和NCI-H460-NC细胞以500～1 000个∕孔铺至96孔板，轻轻混匀，置于37℃培养箱继续培养，20 μl∕孔加入MTT溶液，37℃避光孵育4 h，弃孔内液体，加入DMSO 100 μl，置于37℃摇床快速振荡15 min，充分溶解，酶标仪检测492 nm处OD值。

将上述2种稳转细胞以5×103个∕孔铺于24孔板孵育48 h，弃培养基，加入含有EdU的培养基（1：1 000稀释），多聚甲醛固定，甘氨酸清洗，含0.5%Triton X-100的PBS清洗，阿波罗染色，依次采用0.5%Triton X-100的PBS、甲醛和PBS清洗，DAPI染色，PBS清洗，荧光显微镜下观察。

1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭 实验前12 h更换为无血清培养基，将40 μl matrigel基质胶铺于Transwell小室，消化细胞，1×PBS清洗2次，将500 μl完全培养基加入24孔板，计数，取5×105个细胞重悬，向Transwell小室中加入200～250 μl细胞悬液，保证下层完全培养基与Transwell小室间无气泡。置于培养箱内正常培养48 h，加入甲醇配制、PBS稀释的0.1%结晶紫染液500 μl染色，室温避光15 min，PBS漂洗，棉棒擦拭Transwell小室内部，倒置晾干，倒置荧光显微镜下拍照并计数。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移 将NCI-H460、NCI-H460-ANGPTL1 mimic和NCI-H460-NC细 胞 以5×105个∕孔均匀铺至6孔板，用10 μl白枪头划线并以格尺辅助，加入PBS冲洗细胞碎片，加入含1%血清的培养基，显微镜下拍照并标记，此时记为0 h，继续于37℃、5%CO2培养24 h，倒置显微镜下观察细胞运动情况并拍照。

1.2.6 Western blot检测 采用细胞裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，每组提取40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳（70 V，30 min；100 V，90 min），转至PVDF膜（200 mA，3 h），5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗孵育过夜，第2天加入HRP标记的羊兔抗IgG，37℃孵育2 h，ECL发光液显影。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，采用t检验进行分析。所有数据符合正态分布，计数资料采用χ2检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA查询ANGPTL1在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达及其与预后的关系TCGA查询结果显示，肺癌组织中ANGPTL1表达明显低于癌旁正常组织（P＜0.05），ANGPTL1高表达肺癌患者生存时间明显长于ANGPTL1低表达患者（P＜0.05，图1）。

图1 TCGA查询ANGPTL1在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达及其与预后的关系Fig.1 Expression of ANGPTL1 in lung cancer tissues and normal tissues adjacent to cancer and its relation⁃ship with prognosis by TCGA

2.2 ANGPTL1在细胞中的表达RT-PCR结果见图2，ANGPTL1 mRNA在多种人肺癌细胞株中呈低表达，与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比差异显著（P＜0.05），其中NCI-H460细胞中ANGPTL1 mRNA表达最高，因此，选择NCI-H460细胞进行后续实验。NCIH460-ANGPTL1 mimic组细胞ANGPTL1 mRNA表达明显高于NCI-H460和NCI-H460-NC组（P＜0.05），提示过表达ANGPTL1细胞系构建成功。

图2 ANGPTL1在各细胞系中的表达Fig.2 Expression of ANGPTL1 in various cell lines

2.3 ANGPTL1过表达对肺癌细胞株NCI-H460增殖能力的影响MTT实验结果显示，第2、3、4天NCI-H460-ANGPTL1 mimic组细胞增殖率明显低于NCI-H460和NCI-H460-NC组（P＜0.05，图3），NCIH460-ANGPTL1 mimic组48 h EdU阳性率明 显 低于NCI-H460和NCI-H460-NC组（P＜0.05，图4）。

图3 MTT检测细胞增殖能力Fig.3 MTT assay for cell proliferation

图4 EdU检测细胞增殖能力（×400）Fig.4 EdU detects cell proliferation ability（×400）

2.4 ANGPTL1过表达对肺癌细胞株NCI-H460侵袭能力的影响Transwell结果显示，NCI-H460-ANGPTL1 mimic组通过matrigel基质胶的细胞数明显少于NCI-H460和NCI-H460-NC组（P＜0.05，图5）。

图5 ANGPTL1过表达对肺癌细胞株NCI-H460侵袭能力的影响（×400）Fig.5 Effect of ANGPTL1 overexpression on invasive ability of lung cancer cell line NCI-H460（×400）

2.5 ANGPTL1过表达对肺癌细胞株NCI-H460迁移能力的影响 细胞划痕实验结果显示，NCIH460-ANGPTL1 mimic组细胞迁移率明显低于NCIH460和NCI-H460-NC组（P＜0.05，图6）。

图6 ANGPTL1过表达对肺癌细胞株NCI-H460迁移能力的影响Fig.6 Effect of ANGPTL1 overexpression on migration ability of lung cancer cell line NCI-H460

2.6 ANGPTL1过表达对肺癌细胞株NCI-H460中Drp1、PGAM5和Bax蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，NCI-H460-ANGPTL1 mimic组细胞中PGAM5和Bax蛋白表达明显高于NCI-H460和NCI-H460-NC组，而Drp1表达明显低于NCI-H460和NCI-H460-NC组（P＜0.05，图7）。

图7 ANGPTL1过表达对肺癌细胞株NCI-H460中Drp1、PGAM5和Bax蛋白表达的影响Fig.7 Effects of ANGPTL1 overexpression on Drp1，PGAM5 and Bax proteins expressions in lung can⁃cer cell line NCI-H460

3 讨论

近30年内我国肺癌发病率和死亡率均呈上升趋势，位居恶性肿瘤死亡率榜首，多个城市中肺癌是第一位死亡原因，备受临床与流行病学研究者关注［7］。肺癌临床治疗多采用手术、放疗与化疗等传统方法，随分子生物学技术发展，肺癌靶向治疗迅速发展，但高敏感性生物靶点尚未明确［8］。肿瘤侵袭和迁移是多因素、多阶段和多步骤过程，文献报道称肺癌细胞脱落可顺着间隙侵袭蔓延至淋巴管，经淋巴循环扩散增殖，多个肺癌细胞发展形成微转移病灶，从而导致患者病情恶化甚至死亡［9］。研究认为，肿瘤发生发展与促癌基因和抑癌基因、DNA去甲基化密切相关［10］。ANGPTL1是血管正常生长必需因子，多中心研究认为其在恶性肿瘤进展过程中发挥重要作用［11-12］。探索ANGPTL1在肺癌中的作用机制，有助于肺癌早期诊断与靶向治疗。

ANGPTLs作为分泌性糖蛋白家族，包括氨基酸C-端纤维蛋白原类似结构域、N-端卷曲螺旋结构域及疏水性分泌信号肽，研究表明其与血管生成素结构域相似，可与VEGF协同调控血管生成［13-14］。采用免疫组织化学检测发现，ANGPTL1在直肠癌组织中表达明显低于癌旁正常组织，且与肿瘤分化程度、临床分期和淋巴结是否转移密切相关［15］。本研究TCGA查询结果显示，肺癌组织中ANGPTL1表达明显低于癌旁正常组织，ANGPTL1高表达肺癌患者生存时间明显长于ANGPTL1低表达患者，提示ANGPTL1在肺癌中可能是抑癌基因。为进一步观察ANGPTL1在肺癌中的作用机制，本研究采用RTPCR证实ANGPTL1在多种人肺癌细胞株中呈低表达，与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比差异显著，提示ANGPTL1可能在肺癌中发挥抑制作用，其中NCI-H460细胞中ANGPTL1表达最低，因此选择NCI-H460进行后续实验。MTT、EdU实验、Transwell和划线迁移实验结果显示，过表达ANGPTL1，NCIH460细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力显著降低，提示ANGPTL1对肺癌细胞具有抑制作用，进一步提示ANGPTL1在肺癌发生发展过程中发挥重要调节作用，有望成为肺癌治疗及预后的标志物。

肿瘤细胞异常增殖和血管形成均离不开细胞生物能量，线粒体是ATP的主要产生部位［16］。Drp1是参与线粒体凋亡分裂的活化蛋白，在线粒体动力学调控过程中扮演重要角色，其表达下调可引起线粒体延伸，从而抑制线粒体分裂［17］。文献报道，敲除Drp1可明显抑制乳腺癌细胞转移能力［18］。PGAM5作为线粒体上的重要能量酶，是一种糖酵解酶，其异常激活可导致活性氧簇（ROS）增多，从而导致细胞坏死。近期研究发现，细胞坏死期间PGAM5和Drp1可形成“线粒体攻击复合物”［19］。Bax是Bcl-2家族成员，是促细胞凋亡基因［20］。本研究Western blot检测结果显示，NCI-H460-ANGPTL1 mimic组细胞中PGAM5和Bax蛋白表达明显高于NCI-H460和NCI-H460-NC组，而Drp1表达明显低于NCI-H460和NCI-H460-NC组，提示过表达ANGPTL1可能通过抑制Drp1、激活PGAM5和Bax抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移，ANGPTL1可作为新型肿瘤标志物和潜在肺癌治疗靶点。