血浆p16、ANXA-1抗体在非小细胞肺癌患者的表达变化及其作为诊断标志物的探讨

赵 欢 张 萱 韩志峰 马小莉（青岛大学附属青岛市立医院内分泌科，青岛266071）

哺乳动物细胞周期的顺利进行得益于细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白（cyclin-dependent protein kinase inhibitors，CKIs）的协同作用及平衡调节，细胞周期中设有多个调控点以保障其顺利有序进行，其中，G1-S期是最为关键的调控点。正常生理情况下，细胞分化增殖过程中，CyclinD1与CDK4、CDK6相互作用形成复合物，促进Rb蛋白磷酸化失活及转录因子E2F1释放入核。进入细胞核的E2F1与靶基因启动子结合促进S期相关基因转录，细胞由G1期进入S期。p16蛋白是G1晚期的负性调控因子，通过与CyclinD1蛋白竞争性结合CDK4及CDK6抑制CDK4∕6介导的Rb蛋白磷酸化，导致细胞周期停滞于G1期［1-2］。CyclinDl∕p16∕Rb信号传导通路的任一环节异常都可能导致细胞周期紊乱，导致肿瘤发生。与多数正常组织微量表达或几乎不表达不同，多个文献报道了多种实体肿瘤内p16蛋白过度表达，且与肿瘤发生及其恶性生物学行为有关［3］。

膜联蛋白A1（Annexin A1，ANXA-1）是钙离子依赖性磷脂结合蛋白超家族成员，在调控炎症反应、细胞增殖和分化、凋亡细胞吞噬清除等过程中发挥重要作用［4］。研究发现，ANXA-1在COPD及NSCLC中 表 达 上 调［5］。ANXA-1可 通 过ANXA-1∕NF-κB∕miR-26a信号通路增强NSCLC细胞中核因子NF-κB活 化，促 进 肿 瘤 侵 袭 与 转 移［6］。敲 除ANXA-1基因可抑制NSCLC细胞增殖，迁移和侵袭［4］。表明ANXA-1可能在NSCLC发生、进展中发挥重要作用［7］。

肿瘤发生早期，异常表达的肿瘤抗原可被机体免疫系统识别，激活体液免疫应答，导致相应抗体产生，称为肿瘤相关自身抗体（tumor associated autoantibody，TAAb）［8-9］。部分TAAb在临床症状出现前即可在患者血液中检测到，为寻找潜在肿瘤早期诊断标志物提供依据。目前已在多种肿瘤细胞中检测到p16、ANXA-1自身抗体，如肝细胞癌、乳腺癌、食管癌、宫颈癌［10-13］。NSCLC患者血浆中也检测到p16、ANXA-1抗体，但p16、ANXA-1自身抗体能否作为肺癌诊断的肿瘤标志物尚未明确。本研究采用抗原表位预测工具设计、合成抗原多肽（p16a、p16b、ANXA-1），采用自行建立的优化ELISA法检测NSCLC患者血浆p16、ANXA-1抗体表达情况，分析其表达与临床病理特征的关系及其对NSCLC的诊断价值，以期为NSCLC诊断提供新思路。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取2014年11月至2018年8月于吉林大学中日联谊医院胸外科首次确诊的NSCLC患者209例，男性131例，女性78例，年龄33～79岁，平均年龄58岁。根据2009年国际抗癌联盟UICC肺癌TNM分期标准，Ⅰ期20例，Ⅱ期100例，Ⅲ期40例，Ⅳ期49例。所有患者未接受过抗肿瘤治疗（放化疗或手术治疗），且所有患者均经手术切除肺组织病理学检查确诊。排除有恶性肿瘤家族史或合并其他肿瘤及患有自身免疫性疾病者。同时，选取同期健康志愿者193例作为正常对照组，男性103例，女性90例，年龄33～79岁，平均年龄58岁。根据病例资料，统计NSCLC组人口学信息，如年龄、性别、吸烟状况，及临床分期、病理类型、分化程度、肿瘤大小、是否有淋巴结转移等病理学信息。本研究经青岛大学附属青岛市立医院伦理委员会批准，所有受试者知情同意。

1.1.2 主要试剂 抗原肽委托上海吉尔生化有限公司合成；96孔酶标板购自美国Thermo Fisher Scientific公司；1.0 mol∕L磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲片、小牛血清白蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司；过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体购自英国Abcam公司；显色剂、终止液购自美国Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 清晨、空腹状态下采集静脉血5 ml，4℃、2 500 r∕min离心10 min，收集上层血浆进行检测，剩余血浆于-80℃保存。

1.2.2 抗原肽设计、合成 采用生物信息学数据库及表位预测软件（http：∕∕www.iedb.org）设计抗原肽：对目标蛋白p16、ANXA-1进行序列分析，评估其pH值、亲水性、柔性、抗原性、表面可及性等，根据每段序列与HLA-Ⅱ51个等位基因分子的结合力筛选目标分子结构中潜在的T细胞表位，预测每段序列潜在的B细胞表位，评分，对满足上述要求的抗原片段进行综合评估，并根据抗原设计的一般原则对抗原片段进行适当调整，如N段亲水性氨基酸的添加以增加片段亲水性等，最终设计并委托上海吉尔生化公司合成3条抗原肽，分别为p16a、p16b、ANXA-1，p16a、p16b来源于p16蛋白，其分子结构中包含不同B细胞表位，3条抗原肽序列信息见表1。

表1 抗原肽序列信息Tab.1 Sequences information of antigen peptides

1.2.3 ELISA法检测p16、ANXA-1抗体 将抗原肽稀释至工作浓度（20 μg∕ml），100 μl∕每孔，4℃孵育过夜，0.1%PBST洗板3次，200 μl∕孔加入半胱氨酸溶液（10 μg∕ml）室温避光封闭1 h，洗板2次后放入40℃烘箱干燥2.5 h，4℃放置1周，按照课题组前期方法进行抗体检测［14-15］。0.1%PBST洗板2次，0.5%小牛血清白蛋白（BSA）1：100稀释后每孔加入50 μl，室温孵育1.5 h，洗板3次，加入用0.5%BSA 1∶25 000稀释的过氧化物酶标记的IgG二抗50 μl，室温孵育1 h。50 μl∕孔加入显色剂，室温避光反应25 min，加入25 μl终止液终止反应，15 min内采用自动酶标仪检测450 nm标准波长和620 nm参考波长处吸光度（OD）。每板均设空白对照、阳性对照。所有样本设复孔，以2孔测定值的平均值表示该样本OD值。所有样本重复测定2次，以2次OD值的平均值进行数据分析。以特异性结合指数（SBR）表示血浆p16、ANXA-1抗体水平，SBR=（OD样本-OD阴性对照）∕（OD阳性对照-OD阴性对照）。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，采用Kolmogorov-Smirnov检验对计量资料进行正态性检验，NSCLC组及健康对照组血浆p16、ANXA-1抗体水平及不同TNM分期NSCLC患者抗体表达水平均呈正态分布，以±s表示，组间比较采用Student′st检验。不同TNM分期NSCLC组抗体表达水平两两比较采用LSD检验。NSCLC组及健康对照组性别、吸烟情况等比较采用χ2检验。采用Graphpad prism 5.0软件绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并分析p16、ANXA-1抗体对NSCLC的诊断价值，计算最佳截断值、灵敏度及特异度。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组及健康对照组临床资料比较NSCLC组包括腺癌124例，鳞癌85例（图1）；如表2所示，TNM分期Ⅰ期20例，Ⅱ期100例，Ⅲ期40例，Ⅳ期49例。NSCLC组与健康对照组的性别、年龄、吸烟情况差异无统计学意义。

图1 NSCLC患者病理及免疫组化特征（HE染色，×40）Fig.1 Pathological and immunohistochemical features of NSCLC patients（HE staining，×40）

表2 NSCLC组及对照组临床资料比较［±s，例（%）］Tab.2 Comparison of clinical characteristics between NSCLC group and control group［±s，n（%）］

表2 NSCLC组及对照组临床资料比较［±s，例（%）］Tab.2 Comparison of clinical characteristics between NSCLC group and control group［±s，n（%）］

Note：SCC.Squamous cell carcinoma；AC.Adenocarcinoma.

Variables Age（year）Gender Male Female Smoking history No Yes Histology SCC AC TNMⅠⅡⅢⅣNSCLC 58.6±8.7 131（62.7）78（37.3）103（49.3）106（50.7）85（40.7）124（59.3）20（9.6）100（47.8）40（19.1）49（23.5）Control 58.6±9.3 103（53.4）90（46.6）93（48.2）100（51.8）N∕A N∕A N∕A N∕A N∕A N∕A χ2∕t-0.06 3.58 0.05 P 0.96 0.06 0.83

2.2 多组间血浆p16、ANXA-1抗体表达水平比较 如表3所示，NSCLC组血浆p16a抗体表达水平显著高于健康对照组（P＜0.001），且NSCLC患者早期（Ⅰ期）即出现p16a抗体表达增加，随肺癌进展，其表达水平逐渐升高。NSCLC患者血浆ANXA-1抗体表达较健康对照组显著增加，且在Ⅱ～Ⅳ期患者中增加更为显著（P＜0.05）。NSCLC组与健康对照组p16b抗体表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。不同TNM分期患者血浆p16、ANXA-1抗体表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组血浆p16、ANXA-1抗体表达水平比较（±s）Tab.3 Comparison of expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 in different groups（±s）

表3 各组血浆p16、ANXA-1抗体表达水平比较（±s）Tab.3 Comparison of expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 in different groups（±s）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.001 vs Control group.

Groups Control NSCLCⅠⅡⅢⅣn 193 209 20 100 40 49 p16a IgG 0.53±0.17 0.75±0.182）0.69±0.232）0.73±0.182）0.77±0.142）0.78±0.182）p16b IgG 0.87±0.26 0.89±0.31 0.85±0.41 0.86±0.23 0.93±0.30 0.93±0.41 ANXA-1 IgG 1.01±0.48 1.17±0.482）1.17±0.60 1.16±0.501）1.17±0.431）1.20±0.441）

2.3 NSCLC患者血浆p16、ANXA-1抗体表达与临床病理特征相关性分析 如表4所示，鳞癌患者血浆p16a抗体表达水平显著高于腺癌患者（P=0.02）。高分化患者血浆p16a抗体表达水平显著低于低分化患者（P=0.03）。伴有淋巴结转移的NSCLC患者血浆p16a、p16b抗体表达水平显著高于无淋巴结转移者（P=0.03，P=0.03）。p16a抗体表达与病理类型、分化程度、淋巴结转移相关，p16b抗体表达水平仅与淋巴结转移有关。NSCLC患者血浆ANXA-1抗体表达与年龄、性别、吸烟状况、病理类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期均无关（P＞0.05）。

表4 NSCLC患者血浆p16、ANXA-1抗体表达与临床病理特征相关性（±s，n=209）Tab.4 Relationship between expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 and clinicopathological parame⁃ters of NSCLC patients（±s，n=209）

表4 NSCLC患者血浆p16、ANXA-1抗体表达与临床病理特征相关性（±s，n=209）Tab.4 Relationship between expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 and clinicopathological parame⁃ters of NSCLC patients（±s，n=209）

Note：SCC.Squamous cell carcinoma；AC.Adenocarcinoma.

Variables Gender Male Female Age（year）≥60＜60 Smoking history Yes No Histology SCC AC Differentiation grade Well∕Moderate Poor pT 1～2 3～4 N Present Absent TNMⅠ～ⅡⅢ～Ⅳn 131 78 104 105 98 111 85 124 102 107 205 4 102 107 120 89 p16a IgG 0.77±0.16 0.72±0.20 0.77±0.17 0.73±0.19 0.76±0.18 0.73±0.17 0.78±0.17 0.72±0.18 0.72±0.18 0.77±0.17 0.75±0.18 0.73±0.17 0.77±0.16 0.72±0.19 0.73±0.19 0.77±0.16 t 1.96-1.56-1.78-2.31 2.23 0.16-2.13-1.91 P 0.05 0.12 0.09 0.02 0.03 0.87 0.03 0.06 p16b IgG 0.89±0.29 0.89±0.36 0.92±0.35 0.86±0.27 0.90±0.31 0.88±0.25 0.91±0.33 0.87±0.30 0.87±0.29 0.91±0.33 0.89±0.31 1.00±0.49 0.94±0.35 0.84±0.26 0.86±0.27 0.93±0.36 t 0.34-1.43-1.03-0.84 0.99 0.71-2.26-1.75 P 0.74 0.16 0.23 0.40 0.32 0.48 0.03 0.08 ANXA-1 IgG 1.21±0.47 1.10±0.51 1.22±0.44 1.12±0.52 1.16±0.34 1.13±0.46 1.19±0.44 1.15±0.51 1.12±0.45 1.22±0.51 1.17±0.48 1.20±0.62 1.22±0.46 1.13±0.50 1.16±0.52 1.19±0.43 t 1.66-1.37-1.19-0.59 1.43-0.14-1.37-0.39 P 0.10 0.17 0.32 0.55 0.16 0.89 0.17 0.70

2.4 血浆p16抗体和ANXA-1抗体对NSCLC的诊断价值 采用ROC曲线评价血浆p16抗体和ANXA-1抗体对NSCLC的诊断价值，结果如图2、表5所示，p16a抗体AUC为0.816（95%CI：0.774～0.857），截断值为0.61，诊断灵敏度为78%，特异度为75%。p16a抗体对Ⅰ期患者诊断的AUC为0.701（95%CI：0.575～0.828），诊 断 灵 敏 度 为55%，特异度为81%，提示p16a抗体对早期NSCLC有辅助诊断价值。p16a抗体对Ⅱ～Ⅳ期的诊断效能稍高于Ⅰ期，AUC分别为0.805、0.869、0.843，诊断灵敏度分别为77%、90%、74%，特异度分别为75%、75%、83%。ANXA-1抗 体AUC为0.614（95%CI：0.559～0.669），截断值为1.04，诊断灵敏度为57%，特异度为67%。p16b抗体AUC为0.502（95%CI：0.446～0.559），对NSCLC的诊断效能较差。

图2 血浆p16、ANXA-1抗体诊断不同分期NSCLC的ROC曲线图Fig.2 ROC curve of diagnostic value of p16 and ANXA-1 antibodies for different stages of NSCLC

表5 p16、ANXA-1抗体对不同分期NSCLC诊断效能的ROC曲线分析（%）Tab.5 ROC curve analysis of diagnostic efficacy of circu⁃lating antibodies against p16 and ANXA-1 in dif⁃ferent stages of NSCLC（%）

3 讨论

作为机体抗肿瘤免疫应答产物，虽然肿瘤相关自身抗体产生的机制尚未阐明，但大量研究表明其可能与肿瘤发生、发展及预后密切相关。QIU等［16］通过检测肺癌诊断1年前患者血清中LAMR1自身抗体水平发现，其表达较对照组显著升高，且越接近疾病诊断时升高趋势越为明显。课题组前期研究发现，survivin抗体表达水平较高的NSCLC患者术后生存期较表达水平较低组显著延长，为从众多肿瘤相关自身抗体中寻找可用于NSCLC早期诊断或预后的生物标志物奠定了基础［15］。作为肿瘤标志物，自身抗体具有以下优点：结构稳定、不易被蛋白酶水解、可在血清稳定存在较长时间（半衰期7～30 d），并经过免疫放大效应，即使在肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAAs）浓度较低时仍可以高水平存在［17-18］。使自身抗体与其相应的TAAs相比在作为癌症早期诊断生物标志物上更有优势。

作为细胞生长、增殖的负性调节基因，p16在多种实体肿瘤中过表达，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和食管鳞状细胞癌等［19-22］。p16异常表达通常发生在肿瘤早期，为探索p16抗体作为肿瘤早期诊断标志物的价值提供了有力依据。研究发现，p16抗体对早期食管癌、宫颈癌有一定诊断价值［12，23］，但p16抗体对NSCLC早期诊断价值的研究结论尚未统一。ANXA-1分子具有抗炎活性，可通过抑制免疫细胞聚集、迁移及活性削弱机体免疫监视功能，从而促进肿瘤发生、进展。研究报道ANXA-1在COPD及NSCLC中表达上调。因此，本研究推测ANXA-1抗体可预测NSCLC发生。检测NSCLC患者血浆p16、ANXA-1抗体表达情况发现，NSCLC患者血浆p16a、ANXA-1抗体表达水平显著高于健康对照组，且随肺癌进展，两者表达呈逐渐增高趋势，推测p16a、ANXA-1抗体可能参与NSCLC发生发展。NSCLC患者血浆p16a抗体过表达的机制尚未阐明，但大量证据表明p16a抗体过表达可能与p16Ink4a-Rb通路异常有关。Rb蛋白可负反馈调节p16基因表达，肿瘤发生通常伴随Rb蛋白表达缺失，导致p16基因过表达。p16基因过表达可能是机体抗肿瘤的方式，机体试图通过抑制肿瘤细胞增殖抑制肺癌进展，但效果较差［24］。p16a、ANXA-1抗体在NSCLC患者血浆的表达有明显差异，ANXA-1抗体在Ⅱ～Ⅳ期而非Ⅰ期患者中表达增加，提示ANXA-1可能主要在NSCLC中晚期而非早期发挥作用。ANXA-1对NSCLC预后的影响及分子机制目前鲜有报道，仍需大规模回顾性研究进一步阐明。p16a在Ⅰ期NSCLC患者中表达增加，提示p16a可能参与NSCLC发生，有望成为NSCLC早期诊断的生物标志物。采用ROC曲线分析p16、ANXA-1抗体对不同TNM分期诊断价值发现，p16a抗体诊断Ⅰ期NSCLC患者的AUC为0.701，敏感度为81%，提示其对早期肺癌有一定诊断价值；低分化、伴有淋巴结转移的NSCLC患者血浆p16a抗体表达水平显著高于高分化、无淋巴结转移患者，提示p16a抗体可能对NSCLC预后有一定预测价值，且p16a抗体对Ⅱ～Ⅳ期NSCLC的诊断效能优于Ⅰ期，因此，p16a有望成为NSCLC分期预测及预后评估的生物标志物。另外，p16a抗体的表达模式可能具有肿瘤特异性。JIN等［12］发现随食管癌进展，p16a抗体表达逐渐减弱，与p16a抗体在NSCLC中的表达趋势相反。由于p16在多种实体肿瘤中均存在表达异常，仍需进一步探索p16a抗体在其他实体肿瘤中的表达变化，以明确p16抗体对NSCLC的诊断是否具有特异性。本研究为病例对照研究，Ⅰ期患者样本量相对较小，故研究结论存在一定局限性；此外，p16a、ANXA-1抗体参与NSCLC发生发展的分子机制仍需进一步研究。

与重组蛋白相比，线性抗原肽具有非特异性结合少、表位特异性强等优势，且造价低廉、检测技术成熟、操作简便，适用于肺癌高危人群筛查。本研究根据p16分子中2个不同抗原表位分别设计了p16a和p16b 2个抗原肽，通过检测NSCLC患者血浆p16a、p16b抗体表达水平发现，两者在NSCLC血浆的表达趋势截然不同：p16a抗体在NSCLC组表达显著高于健康对照组，而p16b抗体表达与健康对照组统计学差异无统计学意义。不同抗原表位的免疫原性不同，与MHC分子结合后激活B细胞产生抗体的能力也不同［25］。p16a抗原肽所含的抗原表位是触发体液免疫应答、导致p16抗体产生的真正原因，为进一步开发更灵敏的抗体检测方法奠定了基础。

综上所述，p16、ANXA-1抗体在NSCLC中的表达变化提示其可能参与NSCLC发病机制。p16a抗体在NSCLC患者血浆过表达，且随肺癌进展表达逐渐增强，提示p16a抗体对NSCLC早期诊断、分期预测有一定价值。此外，p16a抗体表达与病理类型、肿瘤的低分化、淋巴结转移有关，提示p16a抗体或许与NSCLC预后有关，但仍需大规模回顾性研究进一步验证。