新生抗原癌症疫苗研究进展

许银银，顾宙辉，钱 海*

1 中国药科大学 药物科学研究院，南京 211198；2 上海复星星泰医药科技有限公司，上海200120

癌症疫苗利用肿瘤抗原诱导机体产生持久和特异性免疫应答。肿瘤抗原根据特异性又可分为肿瘤相关抗原和新生抗原[1，2]。肿瘤相关抗原是指在肿瘤细胞和正常细胞中都可能存在的抗原分子，因此容易引发中枢和外周耐受反应[3～6]，导致疫苗的接种效率变低，且有可能造成自身免疫性（autoimmunity）疾病。新生抗原是仅存在于癌细胞上的蛋白质片段，是肿瘤的特异性，在正常细胞中不表达，因此安全性高，能最大限度地降低不良反应和毒副作用，且新生抗原不会引发中枢耐受反应[7，8]。这些特性使新生抗原成为免疫疗法中的有效靶标[9～12]。因此，开发靶向新生抗原的癌症疫苗意义重大。本文对新生抗原癌症疫苗的发展历程、常见剂型、制备过程、递送策略及临床应用进行概述，以期为后续的研究提供参考。

1 发展历程

新生抗原癌症疫苗的研发历时数十年，但是发展缓慢。1988 年，Plaen D 等利用cDNA 文库筛选，在小鼠肿瘤模型中发现了第一个可被T 细胞识别的新生抗原；1991 年，van der Bruggen P 等用基因克隆技术发现人类第一个黑色素瘤特异性抗原MAGE-1；2015 年，Rose-nberg 团队发现KRAS（其是一类鼠类肉瘤病毒癌基因,是人体最难攻克的致癌突变）突变也能产生新抗原；2017 年3 月，Khodadoust M 等发现人类B 淋巴瘤中存在丰富的MHC Ⅱ类新生抗原，抗原肽可与MHC Ⅱ新抗原结合形成MHC Ⅱ——抗原肽复合物，然后被免疫细胞识别以引发免疫反应；2017 年7 月，德国Loquai C 教授利用新抗原制备了RNA 疫苗，发现患者全部能产生免疫反应；哈佛大学Catherine J.Wu 教授制备了新抗原的肽疫苗，成功治愈了黑色素瘤；2020 年武汉华大吉诺因生产的靶向新抗原自身免疫T 细胞的注射液（NEO-T 注射液）获国家药监局临床实验许可。疫苗发展历程见图1。

图1 新生抗原癌症疫苗发展历程

2 新生抗原制备的疫苗形式

新生抗原疫苗的主要剂型主要有四种：树突状细胞（DC细胞）疫苗、病毒载体疫苗、肽疫苗和核酸疫苗[13，14]。

2.1 DC 细胞疫苗

DC 细胞有两种类型：未成熟DC 和成熟DC，在肿瘤抗原的刺激下，未成熟的DC 细胞会吸收抗原转变为成熟的DC 细胞（见图2）。成熟的DC 细胞的特征在于趋化因子受体（例如CCR7）、促炎细胞因子、共刺激分子（CD54，CD80 和CD86）、免疫蛋白体、MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类分子的上调，吞噬能力降低，抗原加工和呈递能力增强，向淋巴组织迁移能力增强，刺激B 和T 细胞能力的增加，从而引发免疫反应，更好地发挥抗肿瘤的作用。新抗原DC 疫苗以诱导和增强DC 细胞的这种强免疫特性为出发点，旨在通过激活机体的免疫反应达到杀死肿瘤的目的。

图2 DC 细胞抗肿瘤机制

新生抗原DC 疫苗制备思路：①新生抗原筛选；②体外分离、纯化DC 细胞；③新生抗原刺激DC 细胞；④未成熟的DC 细胞转变为成熟的DC 细胞；⑤成熟的DC 细胞回输到患者体内。新生抗原DC 疫苗能够安全有效地诱导肿瘤细胞介导的免疫反应，能明显地改善患者的总体存活率[15]。德国Frank Gansauge 的团队制备了LANEX-DC 疫苗，已有治愈肺癌、胶质瘤患者的实例。但是，DC 细胞疫苗的发展也面临一些障碍：首先，DC 细胞在血液中存在浓度较低，所以DC细胞的分离与纯化存在困难；其次，DC 细胞对培养基极为敏感，培养的DC 细胞存在较大的差异性。

2.2 病毒载体疫苗

病毒样颗粒（Virus-like particle，VLP）因具有与天然病毒相似的结构（见图3、图4）而具有抗原性，因缺乏遗传物质而不具有感染性；因此可有效交联B 细胞上的特异性受体，即使在没有佐剂的情况下也能有效诱导B 细胞介导的免疫反应；还可以触发T 细胞介导的免疫反应，以刺激免疫应答增强疫苗功效[16]。腺病毒是最常用的病毒疫苗载体。目前腺病毒使用较多的为E1 或E3 基因缺失的第一代腺病毒。

图3 病毒的结构

图4 病毒样颗粒的结构

病毒载体疫苗的制备：①新生抗原筛选；②病毒载体的制备；③新生抗原使用佐剂加载到病毒样颗粒内部；④病毒载体疫苗回输到体内。由于病毒载体疫苗缺乏靶向性且易被吞噬清除，大大限制了病毒载体疫苗的发展。目前，研究较多的针对新型冠状病毒的重组病毒载体疫苗，它是以病毒作为载体，将抗原基因重组到病毒基因组中，借助病毒将抗原导入到人体内。在Ⅰ期/Ⅱ期临床实验中，中国研制的非复制型5 型腺病毒（Ad5）与英国研制的AZD1222 腺病毒载体疫苗（ChAdOx1）均表现出较高的安全性与较强的免疫反应活性。

2.3 DNA 疫苗

DNA 疫苗的免疫机理是把编码抗原蛋白的基因插入到含真核表达系统的载体上，再将载有外源基因的载体导入到动物或人体内，来引发机体内的抗肿瘤免疫反应。DNA 疫苗具有许多优点：能够有效诱导体液和细胞免疫应答、生产相对简单、生产成本低[17]。利用同一载体即可表达多种抗原。但是，DNA 疫苗存在中枢和外周免疫耐受的问题。

Duperret EK 等[18]报道了一种能够靶向多种抗原的DNA 疫苗，这种疫苗主要通过电穿孔的方式递送，可以诱导MHC-Ⅰ类限制性CD8+T 细胞的免疫应答，能产生强大的免疫激活能力，从而使肿瘤特异性T 细胞杀死肿瘤细胞。在一项临床试验中，Norell 及其同事使用了DNA 质粒疫苗与低剂量的IL-2（白细胞介素-2）和GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）一起给药，以治疗乳腺癌患者，发现疫苗能够诱导长期的免疫应答反应。Vaccibody 公司研制的DNA 疫苗（VB10.NEO），通过利用患者自身的肿瘤特异性新抗原对患者进行个性化治疗，能够诱导强烈的新抗原特异性免疫应答。

2.4 mRNA 疫苗

mRNA 疫苗主要有两种类型：常规的mRNA 疫苗和自扩增的mRNA 疫苗。mRNA 疫苗具有许多优势：安全性高，不存在感染或插入诱变风险；可在体内降解；可通过使用各种修饰途径和不同的递送方法来调节其体内半衰期；生产速度快，是最有前途的疫苗平台[19]。但是，mRNA 疫苗也存在一些缺陷：mRNA 疫苗不稳定，注射之后很容易被代谢清除；mRNA 具有较大的尺寸、较强的亲水性、较多的负电荷，造成了其在细胞膜上难以被动扩散，因此需要有效的策略将mRNA 递送至靶细胞的细胞质内[20]。

Wolff 等，使用mRNA 疫苗平台，证明小鼠肌肉注射编码基因的mRNA 疫苗能够诱导免疫应答；5 年后，Conryet RM等[21]，用编码癌胚抗原（CEA）的mRNA 注射到小鼠体内，其表现明显的抗CEA 抗体反应，由此而开发了第一种mRNA癌症疫苗；德国Loquai C 教授，利用新生抗原制备了RNA疫苗，实验发现13 名患者均在接种疫苗后有了免疫反应。

2.5 肽疫苗

与其他种类的抗原疫苗相比，肽疫苗具有几个优势：稳定性较好、容易合成、成本效率高[22]、副作用较小[23]。最重要的是，肽抗原不易诱发过敏或者自身免疫反应。已有几例有关肽疫苗的报道：Schumacher T 等合成了含有IDHI（R132H）的新抗原多肽疫苗，与小鼠的神经胶质瘤中的MHC Ⅱ分子结合，发现肽疫苗能够有效的诱导免疫反应[24]。奥特等合成了多达20 种新抗原的长肽疫苗，在黑色素瘤患者临床试验中取得了较好的效果。哈佛大学Catherine J.Wu 教授，合成了新抗原肽疫苗，成功治愈了黑色素瘤。但是，多肽疫苗的发展也面临着一些挑战：由于多肽疫苗具有较低的免疫原性且容易通过酶促反应被降解，因此需要正确的递送方式[25]。

为解决肽疫苗免疫原性低的问题，常需要使用佐剂增强机体对抗原的特异性免疫应答。常用的佐剂有明矾、乳剂（AF03、MF59）、Toll 样受体激动剂（AS04 中单磷酰酯A、AS01中QS-21）。还可以用肽疫苗与其他免疫疗法相结合的方法增强肽疫苗的免疫原性，如肽疫苗与免疫检查点阻断剂组合克服了肽疫苗免疫原性低的问题，并诱导更强的抗肿瘤反应[26]。

3 新生抗原的筛选

肿瘤新生抗原的筛选是一个复杂的过程，主要有3 种筛选方法应重点关注（见图5）。

图5 新生抗原的筛选方法

方法A：对正常细胞和肿瘤组织的DNA 进行全外显子组测序，鉴定出肿瘤组织的突变位点[1，12]。然后通过正交验证或RNA 测序（RNA-seq）评估突变位点等位基因的表达[27]。再通过计算机软件预测新生抗原与HLA 结合的亲和力大小[28]，筛选出来与HLA 亲和力较高的新生抗原合成多肽，通过监测IFN-γ、PD-1 等能反映T 细胞活化的共刺激标志物，来鉴定多肽体外的免疫反应活性[29]。有不同的预测算法和软件用于预测或模拟MHC/新生抗原结合能力：NetMHC、NetChop 和NetCTL，可用于抗原加工和肽转运过程中抗原表位的预测[30]。HLAMiner、Polysolver 和Optiptype 能够分别基于NGS 数据和WES 数据确定HLA 分型结果[31]。

方法B：串联小基因构建体的方法。利用串联基因技术，可以同时表达多个多肽分子，有效延长肽链长度，提高多肽的稳定性。具体的做法是先合成了串联小基因（TMG）构建体，然后将其作为体外转录（IVT）RNA 的模板。再将这些IVT TMG RNA 中的每一个单独转染到自体抗原呈递细胞中，然后与TIL 共培养，以确定TIL 是否识别突变的抗原[32]。串联小基因可以电穿孔到自体APC 中。无论采用方法A 或者方法B，都不需要建立患者特异性肿瘤细胞系，可以使用不同来源的T 细胞来筛选新生抗原反应性T 细胞[33]。

方法C：基于数据库或文献的方式，鉴定出肿瘤细胞的特异性突变位点，然后的步骤可以按照方法A 或者方法B 进行。

4 新生抗原疫苗的递送方式

4.1 直接注射IVT mRNA

mRNA 疫苗相比其他类型的新生抗原疫苗具有很多优势：直接以经皮注射的方式把体外转录mRNA（IVT mRNA）注入LN（结内注射），能够增加抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）对新生抗原的捕获量，从而可以有效诱导抗肿瘤免疫反应。Sahin 的团队用编码多表位的合成mRNA疫苗，治疗晚期黑色素瘤患者,发现直接注射IVT mRNA 不仅能提高翻译效率，而且能增强DC 对MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的抗原呈递。由于内在的佐剂能力，这些IVT mRNA 还通过Toll 样受体7（TLR7）信号传导途径促进DC 成熟。因此能够有效激发T 细胞的免疫应答。IVT mRNA 是将遗传信息传递到活细胞中的理想载体，其主要用途之一是将蛋白质递送到活细胞中。Zhou X 等[34]通过引入IVT mRNA，将重链抗体（VHH）或纳米体的可变结构域快速递送到了活细胞，通过在活细胞中表达其IVT mRNA，扩展了纳米体/VHH 的应用。

4.2 体外脉冲DC 疫苗

用特定抗原脉冲或者信使mRNA 转染DC 可以制备新生抗原疫苗[35]。Joshi A 等[36]不仅证明了用趋化因子标记RNA脉冲的DC 能增强抗肿瘤免疫力，也指出了将RNA 转染到DC 中的方法。但体外脉冲DC 疫苗成本较高，劳动强度大，并且需要高技能的技术人员，这极大地限制了其临床的应用。

4.3 生物材料辅助新生抗原疫苗的递送

生物材料可以保护抗原免于降解，并能调节APC 的功能，已被广泛用于疫苗递送。Zhu G 等[37]，研发出了自组装的DNA-RNA 纳米胶囊（iDR-NC），该纳米材料能将DNACpG 和短发夹RNA（shRNA）以及肿瘤特异性抗原转移到淋巴的抗原呈递细胞（APC）中，引发特异性外周CD8+T 细胞的免疫应答并明显抑制肿瘤的生长。Zhu G 等[38]还将埃文思蓝（EB）加入到抗原分子中，设计了新型纳米疫苗（被命名为AlbiVax）。EB 能与人的白蛋白结合完成自组装，有助于增强免疫反应。Luo M 等[39]开发了响应性纳米疫苗，这种纳米疫苗可根据体内的pH 值变化产生响应信号，能够实现抗原的交叉呈递，从而更好地发挥抗肿瘤效果。Démoulins T 等[40]采用了可生物降解的运载工具来保护自扩增复制RNA（RepRNA）、促进DC 输送。他们将RepRNA 封装到壳聚糖纳米颗粒中，可有效地将RepRNA 递送至DC 并诱导体内免疫反应。

5 新生抗原疫苗的临床进展

根据clinical trials.gov 网站的统计，树突状（DC）细胞疫苗研究最多，截止到2020 年8 月份，共开展了230 项树突状细胞的研究，其中95 项已完成临床试验。其次，研究较多的为DNA 疫苗，共进行了206 项研究，已完成临床试验的有89 项。部分新生抗原疫苗的临床开展情况见表1。

表1 部分新生抗原疫苗临床开展情况

肽疫苗、RNA 个性化癌症疫苗已经在临床试验中取得了成功。德国Ugur Sahin 团队通过WES 和RNA 测序鉴定，在13 名Ⅲ期和Ⅳ期黑素瘤患者中，表达的非同义突变，基于筛选的新生抗原合成了RNA 疫苗并通过经皮注射的方式给药[41]。在参与临床实验的13 名患者中，8 名在注射新生抗原疫苗后的12 至23 个月内未复发，在接种疫苗前已经出现扩散的5 例患者中，2 例在接种疫苗后肿瘤明显缩小，1 例在接种PD-1 抑制剂治疗后病情完全缓解。美国波士顿Dana-Farber 癌症中心，为了证明新生抗原的疫苗的可行性、安全性和免疫原性，针对不同的新生抗原，合成了多肽疫苗。在6名接种疫苗的患者中，4 名在接种后25 个月没有复发，而2名患有复发疾病的患者随后用PD-1 抑制剂治疗后发现肿瘤明显消退。编码微卫星（cMS）发生突变可产生免疫原性移码肽（FSP）新抗原，Kloor M 等[42]为了评估基于FSP 的疫苗的安全性和免疫原性，进行了临床试验。证明了FSP 新抗原疫苗安全性高、耐受性好，能持续诱导体液和细胞免疫反应。

6 新生抗原疫苗的局限性

新生抗原疫苗的发展需要克服一些障碍，首先，有些癌症是“感冒肿瘤”（如胰腺癌和结肠直肠癌），对免疫疗法显示出低反应率。如何使用个性化的癌症疫苗、提高反应性T 细胞活性，以结合其他的免疫疗法对“感冒肿瘤”产生协同的治疗效果，需要进一步研究。其次，是肿瘤的免疫逃逸。肿瘤细胞的免疫逃逸主要发生在癌症早期阶段，在复杂的肿瘤微环境中存在很多的免疫抑制机制，来协助肿瘤实现免疫逃逸[43]。一方面，通过MHCI 类分子的下调造成抗原递呈机制的缺陷是其最主要的机制；另一方面，肿瘤细胞还可以通过阻断PD-1/PD-L1 通路，抑制T 细胞活化和细胞因子的产生实现逃逸。新生抗原疫苗如何克服肿瘤细胞的免疫逃逸仍是一大难题。

肿瘤的低突变负荷也是新生抗原疫苗研发的一大阻碍。肿瘤具有多变性，能够产生不同类型的新生抗原。研究的目标就是寻找出新生抗原设计并合成新生抗原疫苗，以此触发T 细胞的白细胞攻击癌细胞。肿瘤细胞的突变频率越高，新生抗原产生的数量越多，具有这种特征的肿瘤免疫治疗应答效果越好，这就是肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）。但是有些肿瘤具有较低的突变负荷，不利于免疫药物起效。具有此类特征的肿瘤患者不适合用癌症免疫疗法。

7 新生抗原疫苗未来发展方向

7.1 新生抗原疫苗的联合应用

新生抗原疫苗与PD-1/PD-L1 抑制剂的联合应用具有较好的发展前景。针对肿瘤细胞免疫逃逸问题开发出了PD-1 抑制剂，其能够激活T 细胞活性、诱导免疫原性因子的分泌。这就解决了新生抗原疫苗难以激活T 细胞的免疫反应的问题。因此，两者的联合使用将成为新生抗原疫苗应用的新策略。DC 疫苗与免疫检查点抑制剂联合使用，在治疗实体瘤和血液瘤方面表现出了明显的临床优势[44]。

7.2 开发多表位疫苗

通过快速丢失表位如MHC Ⅰ类分子下调来抑制抗原的递呈，是肿瘤细胞免疫逃逸的常见机制，因此需要开发多表位疫苗进行接种。针对多个个性化肽表位，通常含有MHCⅠ限制性肽和MHC Ⅱ类限制性肽，能诱导比现有疫苗更广泛的免疫应答[45]。

7.3 佐剂和递送系统

经典佐剂包括TLR 激动剂和将抗原靶向DC 的单克隆抗体。TLR 受体激动剂作为疫苗佐剂被广泛应用。因为它们不仅能促进DC 成熟为免疫原性状态，也能诱导细胞因子和趋化因子的释放，从而引发机体产生持久的免疫应答。针对DC 抗原的单克隆抗体，主要包括抗DEC-205 和CD40 激动剂。DEC-205（CD205）是一种在DCs 上表达的分子，在抗原加工和呈递中具有广泛的应用。CD40 是在抗原呈递细胞（APC）上广泛表达TNF 受体的超家族成员，它能激活APC并促进抗肿瘤T 细胞应答，进而产生抗癌免疫力。由于肿瘤免疫抑制微环境的存在，新生抗原疫苗难以激活体内的抗肿瘤免疫反应。理想的佐剂和接种途径应增强免疫反应，打破耐受性并克服免疫抑制性微环境（TME），因此选择合适的佐剂用于新生抗原疫苗的递送不失为一种有效的策略。

目前，最理想的疫苗递送载体是纳米颗粒。纳米粒子模拟PAMP（病原体相关分子模式），被视为危险信号，并被APC 上的TLR 识别，能够促进疫苗被APC 识别并摄取。基于纳米载体的大小、形状，表面电荷开发的靶向LN 载体可以增强佐剂的递送效率。此外，一些纳米材料表现出固有的佐剂样免疫刺激特征，能进一步促进癌症疫苗的功效。

7.4 与其他常规疗法相结合

新生抗原疫苗与其他常规疗法如靶向治疗、化学疗法、放射疗法的联合应用也具有良好的应用前景。从机械学的角度来看，靶向治疗与新生抗原疫苗疗法具有协同作用。化学疗法与免疫疗法的联合应用，其依据在于化疗可以通过增加抗原产生，改善抗原呈递，增强T 细胞反应，从而增强免疫疗效。肿瘤细胞在进行放射治疗时，由于辐射作用，肿瘤细胞会产生许多新生抗原和促炎细胞因子，从而起到原位疫苗的作用。

8 问题与展望

与其他癌症免疫疗法相比，靶向新生抗原的癌症疫苗具有许多优势：安全性高、不存在脱靶毒性、能有效诱导T 细胞免疫反应。此外，新生抗原癌症疫苗与其他免疫疗法相结合的策略，不仅可解决T 细胞免疫反应活性低的问题，还克服了肿瘤免疫抑制微环境，开发新生抗原癌症疫苗的联合应用是未来治疗癌症的重要策略。但是，新生抗原疫苗的发展也面临着一些挑战：如何解决癌症对免疫疗法固有的低反应率、克服肿瘤细胞的免疫逃逸，针对突变负荷低的肿瘤，如何开展癌症免疫治疗策略，这些是新生抗原癌症疫苗迫切需要解决的问题。