表达IBDV VP2蛋白的基因Ⅶ型重组新城疫病毒的构建及鉴定

杜倩茹，王楠楠，任广彩，叶俊贤，罗 琼,3，容 芳，何献铭，王 婷，刘郁夫,，陈瑞爱,*

(1.华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642；2.华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司，广东 肇庆 526238；3.肇庆大华农生物药品有限公司，广东 肇庆 526238)

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)是一种具有二十面体核衣壳结构的无包膜双链RNA病毒，感染鸡引起急性、高度传染性、免疫抑制性疾病。IBDV超强毒株感染雏鸡，可导致极高死亡率，造成严重经济损失[1-2]。目前国内主要采用低致病力或中等毒力活疫苗免疫雏鸡的方法防控IBDV，但常受母源抗体干扰或流行毒株抗原变异而导致免疫失败，防控效果不佳[3]。

随着反向遗传技术的不断成熟与广泛应用，国内外学者己经证实新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)作为疫苗载体，具有表达外源蛋白的潜力[4]。NDV作为疫苗载体有以下优势：NDV基因组在进行RNA转录时呈现“跳跃”式转录；NDV可在鸡胚中快速高效繁殖，生产成本低；NDV可有效诱导机体产生较强的体液和细胞免疫应答，具有一定的免疫佐剂作用[5]。这些特性使NDV成为理想的病毒载体，但先前NDV载体疫苗研究多以基因Ⅱ型疫苗株LaSota为骨架，以近年来新流行的基因Ⅶ型NDV为载体的报道较少。

IBDV抗原性主要取决于A片段上VP2基因，其编码的VP2蛋白是IBDV主要的结构蛋白，能诱导机体产生中和抗体[6]。因此本研究通过反向遗传技术，以基因Ⅶ型NDV弱毒株为骨架，在NDV基因组P基因和M基因之间的非编码区序列中插入IBDV的VP2基因，获得表达IBDV VP2蛋白的NDV重组病毒，为进一步研发NDV和IBDV新型二联疫苗提供基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒仓鼠肾成纤维细胞系BHK-21、基因Ⅶ型NDV DHN3株全长cDNA克隆质粒pBR322-DHN3mF、辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3由本实验室保存；9～11日龄SPF鸡胚、1日龄和7日龄SPF鸡购自新兴大华农禽蛋有限公司；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自宝日医生物技术(北京)有限公司；根据NCBI网站上公布的IBDV LYZS株的VP2基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成IBDV VP2基因，并克隆至pUC57质粒中。

1.2 主要试剂转染试剂Lipofectamine LTX and Plus Reagent (15338-100)、TRIzol®Reagent (15596-026)购自Invitrogen；ClonExpress Multis One Step Cloning Kit (C113)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)购自上海碧云天生物技术有限公司；IBDV-VP2单克隆抗体由本实验室制备并保存。

1.3 重组质粒pBR322-DHNmF-VP2的构建本研究在NDV P基因和M基因之间插入外源基因IBDV VP2。具体步骤如下：SmaⅠ酶切质粒pBR322- DHN3mF，回收线性片段F1(13 996 bp)做载体备用。以质粒pBR322-mFDHN3为模板分别以引物对FDHN3-F2/R2、FDHN3-SmaⅠ-F3/R3 PCR扩增同源重组用DNA片段F2与F3。再以pUC57-VP2质粒为模板使用引物VP2-F/R扩增IBDV LYZS株的VP2序列，将产物命名为F4片段。PCR反应程序：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸1 min，循环34次。引物序列信息见表1。

取上述制备的4个DNA片段按照物质量的比1∶1∶1∶1进行混合和同源重组，重组产物转化至感受态细胞DH5α中，涂于氨苄培养皿上进行筛选，12～18 h后挑选阳性菌落进行菌液PCR鉴定。

表1 本试验所用的引物序列

1.4 重组病毒rDHN3mF-VP2的拯救将BHK-21细胞培养于6孔板中，待细胞长至80%左右时，将含VP2基因的NDV全长cDNA克隆质粒pBR322-DHN3mF-VP2和辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L和pXJ40-DE3共转染进BHK-21细胞，在37℃、5% CO2培养箱中培养4 d后置于-80℃超低温冰箱保存。将冻存细胞反复冻融3次后，取200 μL离心上清液接种9～11日龄的SPF鸡胚，4 d后检测SPF鸡胚尿囊液中HA效价，将HA≥6 log2的鸡胚尿囊液继续在SPF鸡胚中传3代。以TRIzol法提取尿囊液中RNA，采用RT-PCR法扩增VP2基因插入片段，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 IBDV VP2蛋白表达的鉴定通过Western blot试验鉴定rDHN3mF-VP2感染的BHK-21细胞是否表达VP2蛋白。将第15代的rDHN3mF-VP2以MOI=1的比例感染BHK-21细胞，感染后48 h收获蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳。以1∶1 000倍比稀释的IBDV-VP2单抗为一抗，羊抗鼠酶标二抗的稀释比为1∶10 000，用Azure Biosystems C600多功能分子成像系统成像。

通过间接免疫荧光试验鉴定rDHN3mF-VP2感染的BHK-21细胞是否表达VP2蛋白。将第15代的重组病毒rDHN3mF-VP2以MOI=1的比例感染BHK-21细胞，感染后48 h，用4%甲醛室温固定1 h，经0.5% TritonX-100透化15 min，37℃温箱孵育一抗1 h(1∶500稀释的IBDV-VP2单抗)，37℃温箱孵育二抗1 h(1∶500稀释的FITC标记羊抗鼠二抗)后，于倒置荧光显微镜下观察荧光。

1.6 重组病毒rDHN3mF-VP2的部分生物学特性为验证VP2基因是否能在重组病毒中稳定传代，分别从重组病毒rDHN3mF-VP2的F5、F15、F30代鸡胚尿囊液中提取RNA，利用VP2-F/R引物对，以RT-PCR和测序的形式检测VP2基因在NDV中的稳定性，引物序列见表1。

为评价VP2基因插入对NDV毒力的影响，收获重组病毒rDHN3mF-VP2的第10代SPF鸡胚尿囊液，参考OIE标准流程测定重组病毒和亲本株的HA、TCID50、EID50、最小致死量鸡胚平均死亡时间(mean death time,MDT)等病毒毒力指数，试验重复3次。

为评价重组病毒和亲本毒对BHK-21细胞的适应性，待BHK-21细胞在6孔板中长至80%～90%时，以MOI=1的比例感染BHK-21细胞。37℃温箱孵育2 h后弃去病毒液，换成含有0.01% Trypsin DMEM培养液。感染后4，8，16，24，36，48，60 h收获感染病毒液，测定不同感染时间的病毒TCID50，绘制病毒生长曲线。

1.7 统计学分析采用Graphpad Prism 5.0软件中t检验方法对两组间数据进行统计学分析，以P<0.05为两组数据间具有显著性差异。

2 结果

2.1 重组质粒pBR322-DHN3mF-VP2的鉴定以VP2-F和DHN3-SmaⅠ-R3为引物，可扩增出大小约2 858 bp的目的条带，大小与预期相符。测序结果显示，重组质粒中的VP2基因序列与模板一致，表明重组质粒pBR322-DHN3mF-VP2构建成功。

2.2 rDHN3mF-VP2重组病毒的RT-PCR鉴定提取重组病毒尿囊液中病毒RNA，用引物VP2-F/DHN3-SmaⅠ-R3扩增重组病毒的VP2基因序列。结果显示，琼脂糖凝胶电泳显示产物的条带大小与预期一致。经测序验证，PCR扩增产物序列与目的基因VP2序列一致(图1)。

M.DL8000 DNA Marker;1～2.rDHN3mF-VP2;3.阴性对照

2.3 rDHN3mF-VP2重组病毒的Western bolt鉴定重组病毒rDHN3mF-VP2感染BHK-21细胞48 h 后收获细胞蛋白，以抗IBDV VP2鼠源单抗为一抗，通过Western blot检测感染细胞中是否表达VP2蛋白。结果显示，试验组与阳性对照组均能检测出40 kDa左右的条带，与预期相符，阴性对照组则没有检测出目的条带(图2)。

M.蛋白Marker;1.阴性对照;2.阳性对照;3.感染rDHN3mF-VP2的BHK-21细胞

2.4 rDHN3mF-VP2重组病毒的间接免疫荧光鉴定重组病毒rDHN3mF-VP2感染BHK-21细胞48 h 后，通过免疫荧光检测VP2特异性蛋白是否表达。以抗IBDV VP2鼠源单抗为一抗，通过荧光显微镜观察感染细胞中是否能检测出绿色荧光信号。结果显示，试验组细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光，而感染了亲本株的细胞和正常细胞均不能检测出绿色荧光信号(图3)。

A.感染rDHN3mF-VP2 BHK-21细胞;B.感染rDHN3mF BHK-21细胞;C.正常BHK-21细胞

2.5 rDHN3mF-VP2重组病毒的稳定性从重组病毒rDHN3mF-VP2的第5，15，30代鸡胚尿囊液中提取RNA，并用引物M-F/P-R对其进行RT-PCR检测。结果显示，3个代次样本均能扩增出1 985 bp 大小左右的目的条带，与预期相符，并经测序验证。结果表明，IBDV的VP2基因可在NDV中稳定传代(图4)。

2.6 病毒感染BHK-21细胞引起的细胞病变取第5代病毒rDHN3mF-VP2鸡胚尿囊液100 μL、病毒rDHN3-mF鸡胚尿囊液100 μL(阳性对照)、SPF鸡胚尿囊液100 μL(阴性对照)分别感染BHK-21细胞，48 h后观察细胞状态(图5)。结果显示，与对照组相比，感染重组病毒的细胞表现出细胞皱缩、变圆、脱落等细胞病变，死亡细胞明显多于阴性对照组。

M.DL2000 DNA Marker;1.F5代 rDHN3mF-VP2；2.F15代 rDH-N3mF-VP2；3.F30代rDHN3mF-VP2

A.重组病毒rDHN3mF-VP2感染的BHK-21细胞；B.亲本病毒rDHN3-mF感染的BHK-21细胞；C.正常的BHK-21细胞

2.7 rDHN3mF-VP2的毒力指数测定参考OIE关于NDV毒力指数评价的标准流程，检测重组病毒和亲本株的HA、TCID50、EID50、MDT。结果显示，除了重组病毒rDHN3mF-VP2比亲本株rDHN3-mF的HA低1个滴度外，重组病毒的毒力指标TCID50、EID50、MDT与亲本株之间均无显著差异(表2)。

表2 毒力指标测定结果

2.8 rDHN3mF-VP2的生长特性分析将重组病毒和亲本毒以MOI=1的比例接种BHK-21细胞，在感染后4,8,16,24,36，48，60 h收获感染病毒液，测定不同感染时间点的病毒TCID50，绘制病毒生长曲线。结果显示，在感染后4，8，12，24 h，病毒在细胞内不断复制，且重组毒rDHN3mF-VP2与原毒株rDHN3-mF均在感染后36 h左右病毒复制达到峰值，其后则缓慢下降(图6)。结果表明，重组病毒rDHN3mF-VP2与亲本株rDHN3-mF在BHK-21细胞上具有相似的复制曲线。

图6 重组病毒与亲本株在BHK-21细胞中的生长曲线

3 讨论

IBDV一直是危害世界养禽业的重要病原，近年来变异毒株和超强毒株不断出现导致IBDV的流行情况越来越复杂，防控难度越来越大[7]。现阶段国内主要使用的IBDV弱毒活疫苗受母源抗体干扰较大，且存在毒力返强和散毒的风险，因此研制新型疫苗是IBDV研究热点之一[8]。目前国内外已报道多种病毒可作为疫苗载体[9-11]，其中较为成功的载体疫苗是重组表达IBDV VP2蛋白的火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey，HTV)，在国外已有商品化疫苗上市，可对肉鸡提供良好的免疫保护作用[12]。

NDV载体具有较强接受外源基因的能力。李晓芳等[13]用表达水疱性口炎病毒G基因的重组NDV免疫小鼠，可以诱导显著的水疱性口炎病毒中和抗体反应；田开月等[14]构建的重组NDV可正确表达游离形式的4型禽腺病毒Fiber蛋白，并保持亲本毒株的低毒力特征和良好的鸡胚适应性；郑文卿等[15]以NDV疫苗株为载体，构建出共表达鸭肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)1和3型VP1基因的重组NDV，并且能够在鸭体内产生针对DHAV-1和DHAV-3的中和抗体，具有成为鸭肝炎重组病毒活载体疫苗的潜力。但先前研究多以NDV经典疫苗株LaSota为骨架，而以新流行的基因Ⅶ型NDV为骨架的报道较少。

NDV不同插入位点影响外源蛋白的表达效率及重组病毒的生长特性。ZHAO等[16]在NDV基因组不同位置插入分泌性碱性磷酸酶基因，结果表明，除了L基因后面非编码区，插入到其他位置的重组病毒均能高效表达外源蛋白，但各重组病毒复制能力较亲本毒株均有不同程度的降低。本试验也获得相类似的结果，重组病毒rDHN3mF-VP2在鸡胚中的繁殖滴度要比亲本株低1个滴度。GE等[17]将AIV的HA基因插入到NDV基因组的P与M之间，获得的重组毒株可有效抵抗NDV和AIV H5亚型的强毒株攻击；刘蒙蒙[18]将EGFP和IBV S1基因插入到P基因和M基因之间，也获得高效表达的重组病毒。因此综合考虑靶标蛋白的表达效率和重组病毒的繁殖特性，本研究以NDV基因组中P基因和M基因之间的非编码区作为插入位点。

本研究利用成熟的NDV反向遗传操作系统，成功拯救出重组病毒rDHN3mF-VP2。通过Western blot和IFA试验证明该重组病毒rDHN3mF-VP2可在细胞内表达特异性VP2蛋白，并且保持亲本株低毒力、遗传稳定、良好的鸡胚和细胞适应性等特征。本研究为进一步研制新型IBDV和NDV二联疫苗奠定了前期基础，但该重组病毒的安全性和免疫效力仍然未知，接下来需要利用动物模型系统评价该重组病毒的安全性和免疫原性。