玉屏风多糖脂质体在雏鸡小肠的吸收特性

徐志高，巫辅达，张先东，罗 颖，康天灏，邓 桦，杨 鸿

(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528000)

玉屏风散最早出自宋代张松所著的《究原方》中，是中医扶正固本的经典方剂，由黄芪、白术、防风三味中药按3∶ 1∶ 1的比例组成[1-2]。玉屏风多糖(Yupingfeng polysaccharides，YPF-P)是玉屏风散的有效部位群，是该方剂临床药效的主要物质基础，在调节免疫、抗应激、抗病毒以及抗疲劳等方面发挥着重要作用[3-4]。口服给药是目前中药方剂的主要给药途径，药物进入机体后，主要经胃肠道吸收进入血液循环，最后发挥生物活性，但传统的中药多糖制剂存在着易被氧化分解、受潮易变质以及不易吸收等缺陷[5]。脂质体(liposome)是具有类似生物膜双分子层结构的超微球型载体，具有良好的生物组织相容性、缓释作用、稳定性，是一种极具开发潜力的新型给药载体[6]。前期工作研究发现，玉屏风多糖脂质体(YPF-PL)具有良好的稳定性、缓释作用等，本试验建立雏鸡在体小肠循环灌流模型，以YPF-P为对照，观察YPF-PL在雏鸡小肠的吸收特性，为YPF-PL新型制剂的研发及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器防风、黄芪和白术3味中药购自北京同仁堂大沥分店；YPF-P(含量：92.57%)和 YPF-PL(包封率：86.66%)为实验室自行制备；大豆卵磷脂和胆固醇购自合肥博美生物科技有限公司；赛拉嗪购自吉林省华牧动物保健品有限公司；色谱级甲醇和乙腈购自美国Fisher scientific公司。

真空冷冻干燥机购自美国LABCONCO公司；LC-15C高效液相色谱仪购自岛津企业管理(中国)有限公司；BT100LC/25蠕动泵购自保定创锐泵业有限公司。

1.2 实验动物12只45日龄SPF雏鸡，雄性，体质量(221±8)g，购自新兴大华农禽蛋有限公司，动物许可证为SCXK(粤)2018-0019。

1.3 雏鸡在体循环灌流模型的建立将12只45日龄SPF雏鸡随机分为2组，分别为YPF-PL和YPF-P组，每组3只，其中YPF-PL组循环灌流质量浓度为20 g/L的YPF-PL 150 mL，YPF-P组循环灌流质量浓度为20 g/L的YPF-P 150 mL。试验前将SPF雏鸡禁食不禁水24 h，称体质量，腹腔注射赛拉嗪(0.2 mL/kg)麻醉，麻醉后固定于手术台上，剪毛，打开腹腔4～5 cm，轻柔取出雏鸡小肠(保持肠系膜完整)，并在所研究的肠段两端(小肠全肠段、十二指肠、空肠和回肠)各插入硅胶管并缝合固定，连接恒流泵和灌流液，形成闭合的循环回路。用41℃的生理盐水冲洗肠段，待肠段内容物排净后，用空气将生理盐水排空，换上预热至41℃的灌流液，并置于恒温磁力搅拌器上(41℃，300 r/min)，以5 mL/min 的灌流速度平衡10 min，然后调至2.5 mL/min 恒速灌流，此时计时开始。用移液器采样2.5 mL于5 mL离心管中，之后分别在不同的时间点采样(15，30，45，60，90，120，180，240 min)，每次采样后补加2.5 mL生理盐水，循环灌流4 h后结束试验，剪下试验肠段，测量肠段长度以及半径。

试验中雏鸡小肠吸收药物的同时，也会吸收大量水分，导致供试液体积变化，因此试验时应对供试液体积进行校正[7]。在循环灌流试验过程中，每次采样之前应该快速用量筒量取烧杯中供试液的体积(Vn)，待试验结束时，用空气排出硅胶管和肠道内的供试液并量取液体体积，此体积为循环回路中肠道与管道的固定体积(V固)，再与烧杯中供试液体积相加，即得该时间点供试液的总体积(Vtn)。

1.4 测定方法脂质体破乳：分别取空白脂质体灌流液和YPF-PL灌流液各2.5 mL于15 mL的离心管中，加入10 mL 50%甲醇溶液，充分混匀，超声处理2 min，对脂质体进行破乳。对YPF-P灌流液采用相同方法处理。

本试验采用柱前衍生化法测定YPF-P中各单糖组分含量[8]，以含量最高的葡萄糖为参考单糖计算所取样品中的YPF-P含量。

利用相应公式计算出各药动学参数，其中肠吸收速率常数(Ka)、药物4 h累计吸收转化率(A，%)、药物吸收半衰期(T1/2,h)、以及表观渗透系数(Papp,cm/s)的计算公式为[9-11]：

公式中Ptn为t时刻供试液剩余药量，Pt0为0时刻供试液剩余药量，Pt4为4 h供试液剩余药量，Δt为时间变化量，Ctn为t时刻供试液中药物质量浓度，ΔQ为灌流4 h吸收总量，r为肠道半径，l为肠道长度。

2 结果

2.1 YPF-PL在雏鸡小肠全肠段累计吸收量对雏鸡在体小肠循环灌流YPF-PL和YPF-P，结果显示，YPF-PL和YPF-P在不同时间段均有不同程度吸收，且灌流4 h结束后雏鸡对YPF-PL的吸收量显著高于YPF-P(P<0.05)(图1)。

图1 小肠吸收药物量与时间曲线图

2.2 YPF-PL和YPF-P吸收参数比较通过建立HPLC分析方法，测得不同时间点循环回路中剩余药量，代入吸收动力学公式，即得YPF-PL和YPF-P各吸收参数(表1)。YPF-PL在雏鸡小肠的平均Ka、A、Papp比YPF-P分别提高了35%，26%,20%，T1/2缩短了26%，且均具有显著性差异(P<0.05)。

2.3 YPF-PL与YPF-P在不同肠段吸收情况利用雏鸡在体肠循环灌流模型，通过灌流相同质量浓度的YPF-PL和YPF-P分别考察十二指肠、空肠、回肠吸收特性，经计算得YPF-PL和YPF-P在雏鸡不同肠段的Ka和A(图2)。YPF-PL和YPF-P在雏鸡小肠的单位吸收量大小顺序均为空肠>回肠>十二指肠；与YPF-P相比，YPF-PL在雏鸡各肠段的吸收均有所提高，在十二指肠、空肠、回肠段的Ka分别提高了17%，28%，12%，吸收转化率分别提高15%，23%，19%，且均具有极显著性差异(P<0.01)。

表1 YPF-PL和YPF-P吸收参数

注：在相同肠段中，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

3 讨论

近年来，学者对中药多糖的研究主要集中在药理作用上，对其吸收动力学的研究严重不足，目前普遍认可的多糖吸收机制有3种：直接吸收机制、肠道菌群吸收机制以及肠道派伊尔氏集合淋巴结吸收机制[12]。有文献报道，小鼠口服同位素125I标记的透明质酸后，能在血液中发现同位素125I标记的透明质酸，利用透明质酸结合蛋白与透明质酸的特异结合性以及色谱柱Sephadxe G-50对透明质酸分子链大小的分离作用，发现口服透明质酸后，胃肠道以单糖及非单糖(包括寡糖和多糖)2种形式吸收[13]。母乳中有多种大小不一、结构不同的多糖，其中人乳寡糖是其中1种，其含量丰富，结构复杂，不能被胃肠道直接消化，但研究发现人乳寡糖可被肠道内定植的微生物菌群所水解，产生小分子有机酸，最终被胃肠道吸收分解，并促进了钙、镁、铁等矿物质的吸收以及降低了胃肠道的pH值[14]。给大鼠饲喂2%岩藻依聚糖2周后，取其肠道组织，经免疫组化染色后，发现岩藻依聚糖大量积累在空肠上皮细胞和空肠固有层中的单核细胞，在一定程度上表明多糖可能被派伊尔氏集合淋巴结吸收[15]。

中药多糖脂质体是指将中药多糖包封于脂质体囊膜内，而脂质体由磷脂和胆固醇组成，属脂溶性物质，可利用细胞膜两侧的浓度差，直接由高浓度向低浓度一侧转运，既不需消耗能量，也不需要载体蛋白的协助。中药多糖脂质体也可以通过胞吞胞饮的方式进入肠上皮细胞，当脂质体与肠上皮细胞接触时，脂质体囊膜与细胞膜相互融合，最后被胞内的多种降解酶降解[15-16]。本试验结果显示，在小肠全肠段考察中，YPF-PL和YPF-P在不同时间段均有不同程度吸收，且雏鸡小肠对YPF-PL 4 h累计吸收量显著高于YPF-P(P<0.05)；YPF-PL在雏鸡小肠平均Ka、A、Papp比YPF-P分别提高了35%，26%,20%，T1/2缩短了26%；提示将YPF-PL包载于脂质体中,提高了雏鸡小肠对YPF-P的吸收速度，增加了YPF-P在小肠的单位吸收量,进而提高了YPF-P的生物利用度。在不同肠段考察中，YPF-PL和YPF-P在雏鸡不同肠段的Ka和A的大小顺序均为空肠>回肠>十二指肠；与YPF-P相比，YPF-PL在雏鸡各肠段的吸收量均有所提高，在十二指肠、空肠、回肠的Ka分别提高了17%，28%,12%，A分别提高15%，23%,19%，且均具有极显著性差异(P<0.05)，表明YPF-PL和YPF-P在雏鸡十二指肠、空肠、回肠都有不同程度的吸收，吸收速率和单位吸收量大小均为空肠>回肠>十二指肠，且与YPF-P相比，YPF-PL在雏鸡各肠段吸收量均有所提高，增强了疗效。

综上所述，YPF-PL和YPF-P在雏鸡十二指肠、空肠和回肠都有不同程度的吸收，吸收速率和单位吸收量大小顺序均为空肠>回肠>十二指肠，与YPF-P相比，雏鸡小肠对YPF-PL的吸收速率快，单位吸收量明显增加，生物利用度高。