牦牛KAT8基因在组织及卵泡发育过程中的表达

海 卓，熊显荣，马鸿程，张 贺，闵星宇，李 键*

(1.西南民族大学 畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学 动物科学国家民委重点实验室，四川 成都 610041；3.青藏高原动物遗传育种资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041)

遗传是一种在不改变碱基遗传序列情况下的修饰遗传，主要包括组蛋白修饰、DNA甲基化修饰、染色质结构修饰及复杂三维基因组排列[1-2]。染色质、染色体是真核生物遗传物质处于有丝分裂及减数分裂特定阶段中的特定形式，其基本单位是由组蛋白H2A、H2B、H3和H4构成的八聚体与DNA紧密缠绕形成的核小体[3]。DNA甲基化修饰在胚胎肾脏输尿管分支的形成、胎盘组织的发育皆具有重要作用[4-5]。近几年组蛋白修饰逐渐被人们所熟知，它是一种由特定相关因子作用于组蛋白特定残基位点的遗传修饰，甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、泛素化等是其主要的修饰途径[6]。组蛋白乙酰化修饰通过组蛋白乙酰化酶(HATs)与去乙酰化酶(HDACs)调节基因转录后的遗传过程，进而影响细胞的分裂分化[7]。目前发现参与修饰的HATs约有15个，根据其结构域的同源性至少可分为3个家族：GCN5与其相关的N-端乙酰基转移蛋白、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CBP)及其类似蛋白(p300、MoZ、YBF2、SAS3、SAS2)和MYST(Tip60)。目前组蛋白乙酰化在动植物相关基因的研究主要集中于MyST家族[8]，MyST家族有组蛋白乙酰基转移酶Tip60(KAT5)、KAT6A、KAT6B、KAT7和KAT8，且这些家族成员在组蛋白氨基酸残基的作用位点并不相同[9-10]。

组蛋白乙酰化酶8(KAT8)又称为MYST1或MOF，除包含C-端HAT结构域外还含有MYST结构域(存在CoA、染色质2个结合位点及C2HC型锌指蛋白)[11]。KAT8主要作用于组蛋白H4的赖氨酸K16残基位点(H4K16)[12]。KAT8最初发现于果蝇体内，参与X染色体遗传物质平衡的剂量补偿过程，并被命名为MOF[13]。有研究表明，KAT8是一种潜在的雌激素受体α(estrogen receptor α，ECα)抑制因子，用RNAi技术干扰其表达可促进细胞增殖[14]。KAT8与天冬氨酸重复蛋白5(aspartic acid repeat-containing protein 5,WDR 5)共同作用于雄激素受体(androgen receptor,AR)靶基因上，从而激活前列腺癌细胞中雄激素依赖基因，且敲除KAT8基因能够显著降低AR靶基因的表达，进而影响雄性生殖系统[15]。在人胚肾293 T细胞中，过表达KAT8不仅能够促进H4K16发生乙酰化，还致使多种组蛋白和非组蛋白发生丙酰化修饰[16]。研究发现，KAT8基因也介导雌性卵巢发育及卵母细胞减数分裂调控[17]。植入前胚胎会因母体KTA8缺失而出现囊胚形成率降低及单个囊胚中总细胞数降低的现象，说明KAT8在雌性生殖过程中发挥着不可替代的作用[18]。

牦牛(Bosgrunniens)是一种生活在高海拔、强紫外线且低氧环境中的高原地区优势物种，是高原地区人民生活保障的必需家畜，具有“全能家畜”、“高原之舟”的美称。与黄牛的繁殖情况不同，牦牛是季节性发情，通常1年1胎或3年2胎，产犊率低下[19]，这严重阻碍了牦牛产业的发展。KAT8作为一种重要的染色质组蛋白修饰因子，在牦牛中的表达水平及作用机制人们尚不清楚。为此，本研究利用RT-PCR技术对牦牛KAT8基因进行克隆和生物信息学分析，对其组织表达谱及该基因在卵母细胞成熟过程中的时序表达规律进行探究，并通过免疫组织化学方法对KAT8在不同发育时期卵泡中的定位进行研究，旨在分析KAT8理化性质及在牦牛生殖过程中的表达规律，为牦牛育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集在秋季选择3头3～5周岁未妊娠的母牦牛，屠宰后立即采集心脏、胃、肾脏、肝脏、肺脏、小肠、脾脏、肌肉、子宫及卵巢组织，利用冻存管收集后置于液氮中暂做保存。采集10头3～5周岁母牦牛卵巢，利用无菌生理盐水冲洗干净，随机分为2份，一份放入4%多聚甲醛(PFA)中进行固定；另一份放入含有双抗(青霉素、链霉素)的30℃生理盐水中暂存，以上样品于3 h内带回实验室。

1.2 主要试剂TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司；核酸助沉剂购自北京百泰克神武技术有限公司；PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒、pMD19-T载体均为TaKaRa公司产品；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒、2×Phanta®Max Master Mix(Dye Plus)由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供；DNA胶回收试剂盒购自康宁生命科学有限公司；DEPC、DNA Marker、感受态细胞DH5α均购自天根生化科技有限公司；Rabbit Anti-MYST1/KAT8 antibody由北京博奥森生物技术有限公司提供。

1.3 卵巢获取及卵母细胞收集在无菌环境下，收集卵巢表面直径为2 ～10 mm卵泡中的卵泡液，转移至直径为90 mm的培养皿中，在体视显微镜下选取颗粒细胞包裹致密、细胞无变形退化的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)50～70颗，用OM液清洗2～3次后于透明质酸酶中脱去颗粒细胞，用PBS洗涤3次，获得生发泡时期(GV期)卵母细胞，放入1.5 mL EP管中备用。分别收集体外培养的第1次减数分裂中期(MⅠ)和第2次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞，用上述方法处理后备用。

1.4 不同时期卵母细胞及各组织cDNA的获得采用TRIrizol法提取各样本总RNA，用核酸浓度测定仪检测总RNA浓度；选取D260/D280值为1.8～2.0的RNA样本，用PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒反转录获得各组织及不同时期卵母细胞的cDNA，收取D260/D280值为1.8～2.0的cDNA样本，-20℃暂存，备用。

1.5 KAT8基因克隆引物和荧光定量引物的设计与合成根据GenBank中登陆的牛KAT8序列 (GenBank登录号：XM_027528321.1)，利用Primer Premier 5.0设计KAT8分段扩增引物KAT8-1和KAT8-2，其扩增片段长度预期为996，942 bp，KAT8全长预期为1 938 bp。利用NCBI中的Primer-BLAST设计KAT8基因实时荧光定量PCR引物及β-actin定量引物(GenBank登录号：XM_027538848.1)。引物均送由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 KAT8 PCR引物及产物长度

1.6 牦牛KAT8基因的克隆及测序以牦牛卵巢cDNA为模板，用KAT8-1和KAT8-2分段扩增KAT8基因，PCR反应体系均为2×Phanta©Max Master Mix (Dye Plus) 25.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA 2.0 μL(0.5 μg/L)，ddH2O 补足至50 μL。PCR扩增程序均为95℃预变性 3 min；95℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸5 min。分段扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外光下切取目的条带，用胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的2段目的片段分别与pMD19-T载体连接，连接体系为5 μL：DNA片段 2 μL，pMD19-T载体0.5 μL，solutionⅠ 2.5 μL，16℃连接过夜。将连接产物分别转入大肠杆菌(E.coli)DH5a感受态细胞中，并将其接种于LB液体培养基中增菌2 h后，4℃环境下8 000 r/min离心15 min收集菌液。将所获菌体分别涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素(Amp)的选择培养基中，于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。用无菌接种环分别挑取目的菌落，接种含Amp的液体培养基中，放在摇床上过夜培养。将获得的菌体送由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，利用DNAMAN将目的序列拼接，获得KAT8基因。

1.7 牦牛KAT8生物学信息学分析利用BLAST在线系统比对物种间KAT8核苷酸序列相似性，通过MAGA 7.0软件构建其系统进化树。将序列输入NCBI-ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)中获得氨基酸序列。通过ExPASy在线软件中的ProtParam (http://web.expasy.org/protparam)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)程序及Npsa-Prabi (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPS)和SWISS_MODEL预测KAT8蛋白质的理化性质、亲疏水性以及该蛋白质的结构。

1.8 KAT8 mRNA的组织表达谱分析以上述反转录的各组织cDNA为模板，β-actin为内参基因(表1)，进行实时荧光定量分析检测KAT8 mRNA在各组织相对表达量。荧光定量PCR总反应体系为15 μL：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA (0.5 μg/L) 1 μL，ddH2O 5.5 μL。荧光定量反应条件：94℃ 预变性3 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s， 39个循环；95℃ 15 s,60℃ 1 min。每个组织检测样本设3个重复组。采用2-△△Ct法计算表达量。

1.9 KAT8在卵母细胞成熟及卵泡发育过程中表达规律分析以1.3中获得的GV期、MⅠ期、MⅡ期卵母细胞cDNA为模板，利用RT-qPCR技术检测KAT8在卵母细胞成熟过程中的表达情况，反应体系及条件参照1.8。每个样本设置3个重复组。采用2-△△Ct法计算表达量。

采用免疫组织化学染色法定位分析KAT8在卵巢中的表达规律。将1.2中已固定的卵巢组织用PBS冲洗干净后进行石蜡切片，按照Rabbit Anti-MYST1/KAT8 antibody说明书稀释(1∶100)，4℃湿润条件下孵育过夜。TBST反复清洗3次，每次5 min，滴加过氧化物偶联鼠兔双标二抗，室温孵育30 min。TBST清洗3次，每次5 min，避光环境下DAB显色液处理15 min；PBS清洗2次，每次5 min，苏木精复染3 min后，进行蓝化、脱水及中性树脂封片镜检。

1.10 生物统计学分析采用SPSS 22.0统计软件的单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)法分析各个组织及不同时期卵母细胞中KAT8相对表达量的差异性。免疫组织切片利用激光共聚焦进行观察拍照，随机选取各发育时期的卵泡。

2 结果

2.1 牦牛KAT8基因的克隆及序列分析以卵巢cDNA为模板，利用分段扩增技术扩增到约996，942 bp片段(图1)。分段扩增产物测序后，通过DNAMAN拼接获得1 938 bp 的KAT8基因，其CDS全长为1 377 bp，共编码458个氨基酸。

M．DL2000 DNA Marker；1,2.KAT8-2和KAT8-1扩增产物

2.2 牦牛KAT8蛋白相关生物信息学分析通过BLAST比对核苷酸发现牦牛KAT8基因与黄牛、野牛、绵羊和山羊的相似性较高，分别为99.64%，99.27%，98.33%，98.04%；与小鼠、马和家兔核苷酸相似性较低，分别为88.67%，90.46%，91.65%(图2A)。利用MAGA 7.0构建系统进化树，结果显示(图2B)，牦牛与黄牛、野牛、山羊和绵羊亲源关系最近，且与核苷酸相似性比对结果一致;说明KAT8在物种进化过程中高度保守。通过ExPASy在线工具预测KAT8蛋白质相对分子质量为52.44 kDa，分子式为C2366H3671N633O690S13，共有原子数7 373个，其理论等电点为8.48，脂肪指数为77.90，不稳定指数为41.26，推测该蛋白质为不稳定蛋白，且在哺乳动物中该氨基酸预估半衰期为30 h。KAT8蛋白中含量较高的氨基酸有赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu)，分别为9.4%，8.3%,8.1%；含量较低的氨基酸有半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和甲硫氨酸(Met)，分别为2.0%，2.0%,0.9%；带负电荷残基的天冬氨酸和谷氨酸(Asp+Glu)有59个，带正电荷残基的精氨酸、赖氨酸和组氨酸(Arg+Lys+His)有77个。蛋白质亲疏水性分析，异亮氨酸(ILe)亲水性4.500，精氨酸(Arg)亲水性-4.500，且该蛋白质中大多数氨基酸残基亲水性数值小于零，最终总亲疏水性平均值-0.584，因此推测KAT8为亲水性蛋白质。蛋白质二级结构预测结果显示，牦牛KAT8蛋白中α螺旋占37.25%，延伸链占17.43%，无规则卷曲占45.10%，无β-转角(图3)。SWISS_MODEL预测三级结构证实,KAT8蛋白三级结构含有ɑ螺旋、无规则卷曲和延伸链，且结果显示延伸链主要位于ɑ螺旋和无规则卷曲结构之间(图4)。

A.牦牛KAT8核苷酸序列相似性分析；B.不同物种间牦牛KAT8蛋白系统进化树分析

紫色指示无规则卷曲(Cc)；蓝色指示α螺旋(Hh)；红色指示延伸链(Ee)

A.α螺旋;B.无规则卷曲;C.延伸链

2.3 牦牛KAT8 mRNA组织表达谱分析以β-actin为内参基因，利用RT-PCR技术分析各组织中KAT8 mRNA相对表达量，并绘制组织表达谱(图5)。结果显示，KAT8在牦牛各组织中广谱表达，在肌肉、心脏和卵巢中相对表达量较高，极显著高于其他组织(P<0.01)；在肺脏、脾脏和胃中相对表达量较低，其中肌肉和心脏无显著性差异，但显著高于卵巢中KAT8 mRNA表达量(P<0.05)。

注：相同字母代表差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

2.4 KAT8在牦牛卵泡发育过程中的表达规律及定位分析采用免疫组织化学方法检测，结果表明KAT8在牦牛各发育时期卵泡中均有表达，表达产物呈褐色或棕褐色(图6)。由图6F可知KAT8主要定位于颗粒细胞，而卵泡膜细胞中相对较少。

A.原始卵泡(100×)；B.初级卵泡(80×)；C.次级卵泡(80×)；D.三级卵泡(50×)；E.优势卵泡(50×)；F.局部放大(100×)。GC.颗粒细胞；TC.膜细胞

2.5 牦牛KAT8 mRNA在卵母细胞成熟过程中表达规律分析以β-actin作为内参基因，利用RT-PCR方法分析KAT8 mRNA在卵母细胞成熟过程中的时序表达规律。结果显示，在卵母细胞减数分裂各时期KAT8均有表达，生发泡期(GV)相对表达量较高，MⅠ期次之，MⅡ期最低，但无显著性差异(P>0.05)(图7)。

图7 牦牛卵母细胞成熟过程中KAT8 mRNA表达规律

3 讨论

目前，有关KAT8的研究主要集中在免疫及造血功能方面[20-21]，然而关于其在卵巢、卵泡发育过程中的表达及作用的研究较少[17]。因此，探讨KAT8在牦牛生殖过程中的表达模式及分子机制尤为重要。本试验利用RT-PCR技术成功克隆出牦牛KAT8基因CDS序列。通过核苷酸相似性分析发现，牦牛、黄牛和野牛KAT8核苷酸序列高度吻合。综上表明，KAT8基因在物种进化过程中高度保守。

研究可知，KAT8在动物不同组织中的作用不尽相同[19-22]，在牦牛各个组织中的相对表达量及在生殖器官及生殖细胞发育过程中的调节机制仍未可知。本研究利用RT-qPCR技术检测牦牛各组织中KAT8 mRNA相对表达量，结果表明，KAT8在牦牛各组织中广谱表达，其中肌肉、卵巢和心脏中表达量较高。有报道已证实KAT8(MOF)对抑制心肌肥大具有关键性作用，与过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶(MnSOD)具有协同作用，可阻断心脏横向动脉缩窄诱导的活性氧基因(ROS)及其下游的c-Raf-MEK-ERK通路，从而抑制心肌肥大[8]。因此，推测牦牛耐低氧特性与其心脏中KAT8 mRNA高表达有关，具体作用机制有待进一步研究。YIN等[17]利用基因编辑技术敲除小鼠卵巢KAT8基因，探究母体卵巢KAT8表达对后续生殖过程的影响，结果发现，敲除鼠卵巢形态与野生型小鼠卵巢形态差异较大，体脂率降低77.4%，且出现了卵泡减少及卵泡表面直径减小的现象。有研究发现，在人正常卵巢组织中KAT8 mRNA在相对表达量显著高于卵巢癌组织[23]。本研究证实，KAT8 mRNA在牦牛卵巢中表达量较高。综上结果表明，KAT8参与卵巢发育，其缺失会严重影响卵巢的正常发育。

为进一步探究KAT8在牦牛卵母细胞减数分裂进程的表达规律，本研究利用RT-qPCR技术检测KAT8 mRNA在牦牛不同时期卵母细胞中的相对表达量，发现GV、MⅠ和MⅡ期卵母细胞表达水平呈下降趋势，这与YIN等[17]对小鼠卵母细胞的研究结果一致。有研究证实，在卵母细胞成熟过程中组蛋白残基逐渐进行乙酰化修饰，GV期乙酰化水平最高，随后降低，同时去乙酰化酶水平随之升高[22]。结合组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及组蛋白去乙酰化酶8(HDAC8)在GV期的表达结果推测卵母细胞GV期较高的乙酰化水平抑制去乙酰化修饰作用[19,24]。有研究表明，KAT8在小鼠卵母细胞不同时期中的表达水平存在显著性差异，GV期显著高于MⅠ和MⅡ期[17]，但本研究中牦牛3个时期卵母细胞表达水平无显著性差异。本试验对核苷酸序列相似性分析发现，牦牛KAT8与小鼠相似性最低，推测该基因在牦牛和小鼠中出现的差异可能与物种特异性及牦牛特殊生存环境有关，具体原因有待进行深入研究。

最后，本试验采用免疫组化对KAT8在牦牛卵巢不同发育时期卵泡的表达定位进行探究，发现KAT8在卵泡各发育期均有表达，且主要定位于卵泡颗粒细胞中。由人正常卵巢及患有癌症的卵巢组织免疫组化结果可知，KAT8在卵巢多种细胞中均表达，但在不同发育时期的正常及患癌卵泡颗粒细胞中的表达量相对其他细胞明显升高[23]。目前KAT8在经济动物生殖过程中的研究尚未见报道。研究KAT8在牦牛不同发育时期卵泡中的表达规律，对进一步探究该基因对雌性牦牛生殖相关的作用机制提供理论依据。