A型流感病毒M基因的研究进展

乔树苗，顾 敏,2,3*，刘秀梵,2,3*

(1.扬州大学 农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏 扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3.江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009)

1 A型流感概述

流感病毒有4种型：A、B、C和D型，其中感染宿主最多样并能引起大流行的是A型流感病毒(influenza A virus,IAV)。进一步根据表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的差异，IAV可被分为18种HA亚型和11种NA亚型。而依据宿主来源，IAV又可被分为人流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒或其他动物源的流感病毒[1-2]。IAV是分8个节段的负链RNA病毒，每个基因节段均与三聚体的病毒聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)以及核蛋白(NP)结合形成病毒核糖核酸蛋白复合体(vRNP)[3]。已知IAV的基因组可编码多达17种蛋白，其中由第7节段M基因所编码的M蛋白是除HA、NA之外的膜蛋白，包括基质蛋白M1(matrix protein 1)、离子通道蛋白M2(ion channel protein)和M42蛋白(M2-null protein)[4-11]。

研究指出，M基因转录后通过不同剪接方式可产生4个剪接转录本。M1蛋白由mRNA未经剪接的MmRNA1转录产生；M2蛋白由mRNA选择性剪接产生的MmRNA2转录产生；而M42蛋白则由选择性剪接产生的MmRNA4转录产生，是一种新的M2相关蛋白，但具有不同于M2的外显子结构域，其胞外结构域的抗原性也与M2蛋白不同，可以在功能上代偿M2蛋白缺陷型病毒中M2蛋白的作用[12-13]。值得注意的是，另外一个剪接转录本MmRNA3不编码蛋白，但与MmRNA2具有相同的剪接位点，当其远剪接位点被聚合酶所阻断方能启动MmRNA2的剪接，因此MmRNA3能够在病毒感染早期充当M蛋白表达的负调控因子[14-16]。此外，M基因mRNA的剪接调控还受到发现于细胞周期蛋白激酶抑制剂中的KH-CB19及其类似物NIH39等剪接调控因子抑制剂的影响。 ARTARINI等[17]研究发现在宿主因子中的细胞分裂周期样激酶1(CLK1)是M基因mRNA剪接必要的相关因子，可以与KH-CB19和NIH39进行特异结合，从而影响M基因的剪接水平并能降低IAV在A549细胞中的复制[18-19]。

2 M基因的遗传进化

根据IAV的感染宿主差异，M基因可被划分为7个进化谱系(图1)，分别为：人谱系Hu1、Hu2，禽谱系Av1、Av2，猪谱系Sw1、Sw2和犬/马谱系CE[20]。其中，人谱系Hu1，包括1918—1954年的H1N1亚型病毒(西班牙流感及其子代病毒)、1957—1967年的H2N2亚型病毒(亚洲流感及其子代病毒)以及1968年之后的H3N2亚型病毒(香港流感及其子代病毒)；而Hu2主要由1977年以后出现的H1N1亚型病毒(俄罗斯流感)所组成[21-22]。进一步的分析发现，Hu1谱系的M基因均从1918大流感病毒衍生而来，虽经历过1957和1968年流感病毒的2次抗原转换，但仍保持着相同的来源；而Hu2谱系M基因尽管最初也来自1918年大流感病毒，但其经历不同的进化过程而形成另一个谱系[22]。禽谱系Av1主要包括来自亚洲的禽流感病毒，Av2则大多来自北美[23]。猪谱系Sw1，位于人和禽谱系之间，主要是北美来源的病毒；而另一个猪谱系Sw2，则从禽谱系Av1分化而来，由1980年后的猪流感病毒所组成，主要来自欧洲[24]。犬/马谱系CE(图1)，从Av2分支的根部分化而来，包括H3N8、H3N2、H7N2等亚型的犬流感病毒或马流感病毒[20,25-26]。通常，上述不同谱系的M基因具有宿主特异性，但猪或禽谱系中的IAV也会导致人感染，例如已知感染人或猪的H5N1亚型病毒均具有禽流感病毒基因组特征，包括禽谱系的M基因[27-28]。

图1 M基因进化谱系简图[20]

研究表明，尽管M1和M2均由IAV的M基因编码，但两者在不同宿主体内受到的选择压力存在差异，表现为独立进化。 FURUSE等[29]通过对获取自GenBank 数据库的流感序列进行M基因的进化分析指出，M2受到的选择压力要大于M1。 NAGUIB等[30]研究也发现，禽流感病毒M2承受着大于M1的选择性压力；但人流感病毒M1基因所受选择性压力又要强于禽流感病毒。祁贤等[31]还指出，M1蛋白的第219位氨基酸在人流感病毒中被鉴定为正选择位点，而该位点在结构上与T细胞和MHC细胞抗原表位有关。此外， BOGDANOW等[32]研究发现M基因在禽适应株和人适应株上具有不同的保守区，其RNA剪接异构体的增加会造成在非适应宿主上M1蛋白不能有效地产生，从而影响病毒对宿主的适应。并且，CALDERON等[33]研究也发现M2蛋白会影响IAV在宿主上的适应与传播，M2过度表达使得IAV在非适应宿主上的复制明显减少。

3 M基因对病毒形态的影响

IAV粒子的囊膜具有多形性，主要为球形和丝状，大小从80～120 nm到几微米，相关的试验证明M1、M2蛋白的关键氨基酸残基以及M1和M2蛋白间的相互作用可能影响流感病毒的形态[34-35]。为病毒膜提供结构和支撑的同时，M1蛋白的结构和功能还决定病毒形成丝状或球形病毒粒子的能力，M1蛋白在病毒膜下形成螺旋网，但其螺旋转弯的节距在丝状和球形病毒粒子中不同。LIU等[36]研究表明A/PR8/1934(H1N1)球形病毒经反复传代，其丝状病毒粒子的增加主要与M1蛋白第87,92,101，157位氨基酸的累积突变相关，通过建模发现这些残基均位于M1二聚体带正电荷的表面。 LIU等[37]还发现M2蛋白胞质尾区第76位酪氨酸到丙氨酸的突变(Y76A)会减少感染性病毒颗粒的产生和细丝状病毒粒子的形成。由于M2蛋白的尾部在与M1结合的过程中具有重要作用，因此M2尾部基因的突变也会改变M1蛋白对丝状病毒粒子形成的影响[38]。

4 基质蛋白M1

作为IAV包膜的主要成分，基质蛋白M1在流感病毒生命周期的多个阶段均起着重要的调控作用，包括脱衣壳、转录、vRNP的核输出、组装和萌发[39]。

M1是IAV颗粒中含量最多的蛋白，位于病毒膜内层；pH为4时以二聚体形式存在，pH为7.4时则以多聚体形式存在[40]。M1基因序列高度保守，由252个氨基酸组成，显微镜下呈现1个球形N端结构域和1个灵活的C端延伸部分[41-43]。N端结构域由分别位于2～67和91～158位氨基酸，2个四螺旋束经1个螺旋结构连接而成，88～164位氨基酸构成的中间结构域介导M1的寡聚并连接vRNP和病毒包膜，C端结构域则由165～252位氨基酸折叠成螺旋并包含一个明显的非结构化区域[44-46]。

IAV子代病毒在细胞膜萌发的过程中，新复制的vRNP需要穿过核膜到达细胞质，才能与内小体一起沿着微管运输到病毒出芽点[47]。然而，病毒出芽部位的HA和NA簇位于质膜上，HA蛋白虽能启动病毒复制但却无法完成病毒萌发。进一步研究发现，M1可能与HA和NA的细胞质尾区域发生相互作用，导致细胞膜弯曲而协助病毒脱衣壳[47-49]。M1既介导对HA诱导病毒出芽的限制，也介导出芽过程所需其他病毒蛋白的招募。M1蛋白能够在病毒复制时直接结合vRNP和核输出蛋白NEP，形成包含有2个核输出信号(NESs)的核输出复合体，同时将vRNP从细胞核运送到细胞质并辅助vRNP组装成病毒颗粒[50-51]。另外，M1还可通过与多种宿主细胞因子互作来调控流感病毒的复制，如WATANABE 等[52]研究发现热休克蛋白HSC70与M1的结合能够抑制M1和NP的核输出，进而抑制病毒复制并影响到病毒的毒力和致病性。

5 离子通道蛋白M2

离子通道蛋白M2是一种具有离子通道活性的跨膜蛋白，在病毒粒子进入宿主细胞、组装、萌发中起重要作用。M2离子通道活性不仅是病毒复制所必须的，而且通过多种途径参与调节细胞内稳态，同时也是离子通道抑制剂型抗流感药物如金刚烷胺、金刚乙胺等的靶点[53-54]。

M2是一种单通道Ⅲ型膜蛋白，锚定于病毒包膜中，由二硫键连接的一对二聚体或四聚体所组成，包含97个氨基酸(M基因第26～51位和第740～1 007 位核苷酸编码)[42,53]。结构上，M2蛋白依次分为胞外区N-末端胞外结构域(ED，1～24位氨基酸)、中间跨膜区(TMD，25～43位氨基酸)、胞内区和C-末端结构域(CTD，44～97位氨基酸)，其中CTD又由两亲性螺旋(APH，45～62位氨基酸)和细胞质尾部(CT，63～97位氨基酸)所组成[56-59]。

5.1 M2蛋白的离子通道活性M2蛋白形成的质子选择性离子通道受细胞环境pH调节，当酸性环境pH值较低时该通道被激活，在vRNP释放到宿主细胞胞质的过程中起重要作用。病毒在受体介导内吞、入侵宿主细胞时，内小体质膜pH降低，运输囊泡将新合成的病毒包膜蛋白(包括M2、HA、NA蛋白)从内质网运输至高尔基体，最终到达细胞膜。通过高尔基体时，离子通道形成的酸性环境将经由溶酶体或者蛋白酶体降解途径来促进转运蛋白的降解，使得胞质中vRNP释放转运到细胞核中，帮助病毒脱壳和释放[60-61]。此外，M2蛋白能够阻止LC3II蛋白与自噬体结合从而干扰细胞自噬，参与病毒在细胞内的脱膜过程[38,47,57]。 BEALE等[62]研究发现，M2胞质尾区不仅含有一个从胞膜出芽所必需的α-螺旋区(45～61位氨基酸)，还包含与胆固醇识别及互作密切相关的氨基酸共识(CRAC)区域和一个与LC3互作的区域(91～94位氨基酸)，该区域的存在能够破坏自噬、维持病毒粒子稳定性。

5.2 M2蛋白与宿主蛋白的相互作用M2蛋白在进入细胞膜的过程中，其胞外区和胞内区直接接触细胞质，与细胞蛋白存在相互作用。M2蛋白可以通过调节pH水平影响细胞其他蛋白的表达，其胞外区被宿主的免疫系统识别后可干扰宿主蛋白并引起宿主细胞炎性因子激活和功能紊乱。TAKESHI等[63]研究表明，M2蛋白的离子通道活性是流感病毒激活单核巨噬细胞和树突状细胞中的炎症小体所必需的。GUAN等[64]研究发现NS1/M2介导的PKR通路有助于流感病毒的复制与释放，协同热休克蛋白Hsp-p58活化PKR通路，促使细胞死亡以及病毒释放[65]。

6 总结

预防流感的有效方法之一是使用疫苗，然而现有的疫苗设计多聚焦于HA和NA蛋白所提供的免疫保护作用，但由于这两种表面糖蛋白的抗原性变异，需要定期地对疫苗株进行更新以确保其与流行株具有良好的抗原匹配，因此研发抗病毒药物以寻求更广泛或更“普遍”的抗病毒作用也显得至关重要。目前，M2离子通道阻滞剂和NA抑制剂是已投入临床使用的两种主要的抗流感药物；而相较于NA，M2蛋白的结构更加稳定，其抑制剂类药物也相对更为广谱。另外，基质蛋白M1在流感病毒的生命周期中，尤其是病毒出芽过程发挥关键作用。因此，进一步研究M1和M2蛋白的结构与功能关系、宿主蛋白所介导M2蛋白在诸如vRNP释放和萌芽等过程的作用，有助于深入理解M基因在流感病毒感染与致病中的相关机理，并靶向M基因开发具有跨亚型保护效果的通用性疫苗或针对IAV复制周期特定阶段的新型抗病毒药物，从而有效应对新型重组IAV、耐药性IAV的出现及其潜在风险。