PTTG和p21作为无功能垂体瘤放射治疗预后的分子标志物

李阳芳，胡慧敏*

(1.北京市神经外科研究所，北京 100070； 2.首都医科大学附属北京天坛医院 神经外科，北京 100070)

垂体瘤(putuitary tumor)起源于颅内腺垂体，是神经外科常见的肿瘤之一，传统流行病学资料中垂体瘤约占颅内肿瘤的10%～12%，年发病率约为(0.8～1)/10万，但有报道称垂体瘤尸检发现率高达14.4%，随机人群磁共振影像(magnetic resonance imaging MRI)检出率为22.5%[1]。 垂体瘤好发于青壮年，较其他颅内肿瘤对人的身心健康更具危害性，对患者的生长、发育、劳动能力、生育功能等都有严重影响。无功能垂体腺瘤(non-functional pituitary adenomas,NFPAs)是垂体瘤中的一种，约占垂体瘤的25%，由于NFPAs在发展初期缺乏临床症状，直至生长为大腺瘤才被发现，这时NFPAs多数已侵犯周围组织呈侵袭性生长，手术难以完全切除并且极易复发[2]，所以结合放射治疗(简称放疗)起到重要的补充作用，但并不是所有的患者都适合放疗，非必要的放疗易引起患者的垂体功能低下和视神经损伤等，造成二次损伤[3]，所以需要筛选关键基因作为分子标志物来预测垂体瘤对放射线的抵抗及敏感。

细胞周期调节因子是DNA损伤修复通路的重要组成部分，正常生理条件下，其能够调控细胞增殖进程，作用于细胞分裂保持细胞增殖；而放疗情况下，由于DNA损伤应答机制的启动，细胞周期通路开始响应并启动细胞周期捕获，参与DNA损伤修复过程，引发放疗抵抗[4-5]。本课题利用NFPAs组织芯片对细胞周期依赖性激酶抑制剂1A(cycle-dependent kinase inhibitor 1A,p21)等与细胞周期相关的蛋白进行检测，结合临床信息分析影响放疗敏感的分子标志物，筛选到垂体瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene,PTTG)和p21 两个能够指示垂体瘤对放射线敏感程度的蛋白，作为放疗预后的预测分子，并初步评估其在预测NFPAs放疗耐受中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

89例无功能垂体瘤样本取自垂体瘤切除术后的组织标本，来源于北京天坛医院神经外科研究所垂体瘤样本库，所有样本来源患者均已签署了知情同意书；本研究获得首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准(KY2019-144-01)。

抗Ki67兔多克隆抗体、 抗PTTG小鼠单克隆抗体、 抗p53 小鼠单克隆抗体、抗p21小鼠单克隆抗体、抗p15兔多克隆抗体、抗p16小鼠单克隆抗体、抗MDM2小鼠单克隆抗体、抗CDK2小鼠单克隆抗体、抗CDK4兔单克隆抗体、抗CCND1兔单克隆抗体、抗CCND3小鼠单克隆抗体、 抗CCNE1小鼠单克隆抗体、抗RB兔单克隆抗体、抗c-Myc小鼠单克隆抗体、抗E2F1兔多克隆抗体和抗E2F4兔单克隆抗体(均英国Abcam 公司)；徕卡免疫组化试剂盒(徕卡生物系统有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 整理患者临床信息及随访资料：包括患者年龄、性别、肿瘤体积、侵袭情况、伽马刀参数(中心剂量、边缘剂量和等剂量线)、头痛、视神经受损及放疗引起的激素缺乏症。患者伽马刀放射外科治疗(gamma knife radiosurgery,GKRS)(简称伽马刀治疗)后的1～10年期间进行随访，并将磁共振影像作为分组依据，与伽马刀治疗前相比，垂体瘤体积缩小≥20%为放疗敏感组，其余为放疗耐受组。

1.2.2 组织芯片的制备：根据伽马刀治疗时间2003—2009年的患者样本为研究组(tissue microarray,TMA-1)；2010—2013年的为验证组(TMA-2)，所有患者均按照统一标准进行伽马刀治疗。所有样本用甲醛固定后进行石蜡包埋；在光学显微镜下，利用苏木精和伊红染色的载玻片选取了每个肿瘤的3个不同区域，然后使用组织芯片仪从石蜡包埋的组织块中取出3个1.0 mm的蜡芯，并在组织微阵列中随机排列，确保每个样本3复孔。使用连续切片机将组织微阵列块切成4微米的切片，即组织芯片，在-20℃保存至使用。

1.2.3 组织芯片的免疫组化染色：组织芯片均使用徕卡免疫组化自动仪进行组织染色，按照徕卡免疫组化试剂盒说明书进行操作；使用一抗的稀释比为: 抗Ki67兔多克隆抗体(1∶500)、 抗PTTG小鼠单克隆抗体(1∶500)、 抗p53 小鼠单克隆抗体(1∶800)、 抗p21小鼠单克隆抗体(1∶400)、 抗p15兔多克隆抗体(1∶500)、 抗p16小鼠单克隆抗体(1∶600)、 抗MDM2小鼠单克隆抗体(1∶200)、 抗CDK2小鼠单克隆抗体(1∶50)、抗CDK4兔单克隆抗体(1∶50)、 抗CCND1兔单克隆抗体(1∶6)、 抗CCND3小鼠单克隆抗体(1∶200)、 抗CCNE1小鼠单克隆抗体(1∶100)、 抗RB兔单克隆抗体(1∶600)、 抗c-Myc小鼠单克隆抗体(1∶200)、 抗E2F1兔多克隆抗体(1∶500)、抗E2F4兔单克隆抗体(1∶500)；抗体染色后，所有组织芯片用树脂黏合剂固定。

1.2.4 组织芯片的判读：利用徕卡Aeprio AT2扫描系统，扫描组织芯片，核查确定肿瘤区域后，去除杂质及非特异染色区，对组织芯片进行判读，同时设定核阳性、浆阳性和膜阳性，并对染色深浅进行打分，总分=1×(1分%)+2×(2分%)+3×(3分%)，总分数为0-300区间。CDK4、PTTG和p21在细胞核和胞质中都有表达，所以分别打分。

1.3 统计学分析

2 结果

研究组的样本共61例，包含27例敏感，34例抵抗；而验证组为28例，包含12例敏感，16例抵抗。收集病人基本资料及临床信息列于表1，结果显示本样本集群的临床数据与放疗抵抗无显著关联。

表1 患者临床信息与放疗抵抗之间的单因素分析

研究组(TMA-1)的 PTTG细胞核和p21细胞质高表达与肿瘤的放疗耐受显著相关(P<0.05和P<0.01)；在验证组(TMA-2)中，再次印证PTTG细胞核和p21细胞质高表达与肿瘤放疗耐受之间的关系(P<0.01)(表2)。

表2 蛋白分子标志物与TMA1和TMA组放疗抵抗之间关系的单因素分析

根据组织芯片PTTG细胞核染色评分(0～150)，将PTTG表达情况分为PTTG核阴性(PTTG-nu-)，即无表达；PTTG核阳性(PTTG-nu+)，包括低表达和高表达。同样，根据p21细胞质染色评分(0～300)，分数为0～149的为p21无表达和低表达(p21-cyL/-)；分数为150～300的为p21高表达(p21-cyH)。PTTG和p21在无功能垂体瘤组织芯片中的蛋白表达情况(图1)。

在研究组中，PTTG细胞核阴性、p21细胞质无/低表达与肿瘤的放疗敏感性高度相关(P<0.01)。验证组再次证明了上述结果(P<0.05)(图2)。

3 讨论

既往研究主要集中于临床信息与垂体瘤复发的关系，对于预测垂体瘤放疗预后的分子标志物的研究鲜有报道。本研究尝试利用肿瘤放疗后体积的变化来反映垂体瘤对射线的敏感程度，并结合临床信息和蛋白表达情况，筛选到PTTG和p21两个能够预测无功能垂体瘤放疗耐受的分子标志物，即细胞核PTTG和细胞质p21表达的升高很可能预示无功能垂体瘤放疗耐受。

PTTG是在垂体瘤中发现的原癌基因，同时也是细胞分裂中重要调节蛋白[6]，在细胞核和细胞质均有表达。在直肠癌的研究中，PTTG就是放射耐受的分子标志物，高表达PTTG的直肠癌表现出放疗抵抗[7]。体外实验也证明PTTG的过表达抑制了癌细胞的凋亡，增强了对射线的抵抗力[8]。这点与本研究的结果相一致。PTTG的机制研究显示，其能够下调了DNA损伤反应基因，包括p53靶基因BRCA1[9]，甚至与p53相互作用抑制p53活性，与ku70相互作用抑制DNA损伤反应，进而抑制癌细胞凋亡[10]。这从机制上解释了：PTTG的表达可能阻止了由射线引起的垂体瘤细胞的凋亡。

细胞衰老是辐射后细胞死亡的重要途径之一。经典的p53/p21信号通路在细胞衰老中起关键作用，有报道称PTTG与p53/p21通路相互作用调节垂体瘤细胞衰老[11]。p21是细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂， 其在亚细胞的定位代表了不同的生物学功能，如核定位显示增殖抑制和细胞周期检查点诱导活性，而细胞质定位则显示抗凋亡和促癌活性[12]。细胞质中的p21能与半胱天冬酶-3酶原(pro-caspase-3)或凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulatting kinase 1,ASK1)联合作用以阻止细胞凋亡，pro-caspase-3是诱导细胞凋亡的重要基因，而ASK1则激活MAPK通路对细胞凋亡做出反应[13-14]。这从理论上印证了本研究的结果，那就是细胞质高表达p21的NFPAs更能抵御放疗引起的细胞凋亡。

Negative, low and high expression of PTTG and p21 in either nuclear or cytoplasm of NFPAs; scale bar=50 μm图1 PTTG和p21在NFPAs组织芯片(TAM)中表达情况Fig 1 Expression of PTTG and p21 in NFPAs tissue microarray(TAM)

综上所述，本研究发现NFPAs细胞核PTTG或细胞质p21表达升高的病人更易于引发放疗耐受，PTTG和p21可能作为NFPAs预后的预测分子，指导垂体瘤临床诊治；预测分子的发现将进一步阐释NFPAs放疗抵抗的机制，开发针对关键基因的药物对放疗耐受进行缓解，增加放射治疗敏感度。

A,B.negative nuclear PTTG and low cytoplasmic p21 were significantly related to radiosensitive (P=0.007 6 and 0.003 4, respectively) in the study set; C, D.nuclear PTTG and cytoplasmic p21 level were significantly related to radiosensitive rate (P=0.042 8 and 0.003 5, respectively) in the validation set