Circ_0038467靶向miR-182调控肺炎链球菌(Sp)诱导的人肺泡上皮细胞系HPAEpiC损伤

刘 青，张 蕾，张利元，王世凤，左立旻*

(电子科技大学医学院附属妇女儿童医院 成都市妇女儿童中心医院 1.急诊科； 2.呼吸科； 3.检验科； 4.病理科， 四川 成都 611731)

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae，Sp)仍然是引起下呼吸道感染的最常见细菌病原体，并且是全世界感染性疾病发病率和病死率的主要原因，尤其是在儿童和老年人中[1]。肺泡上皮细胞是覆盖在肺泡上层具有屏障保护作用的细胞，众所周知，Sp感染引起的肺泡上皮细胞凋亡是肺组织损伤的基础[2]。因此，阐明肺泡上皮细胞凋亡的调控机制对寻找有效的肺炎治疗靶点至关重要。环状RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一类由外显子反向剪切形成的共价封闭的环状结构RNA分子，其通过与miRNA或RNA集合蛋白作用调节细胞中多种基因的表达参与包括肺炎在内的许多人类疾病进展[3]。有研究指出，在脂多糖诱导的支气管上皮细胞损伤中circ_0038467表达增加，circ_0038467敲低显著抑制细胞凋亡并降低促炎因子产生，是肺炎潜在治疗靶点[4]。miR-182是一种炎性相关miRNA，在脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织和支气管肺泡灌洗液中miR-182表达降低[5]。然而circ_0038467和miR-182在，Sp诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用并不清楚。内质网是维持细胞内环境平衡的作用细胞器，外界有害刺激持续存在可破坏内质网的正常功能，导致内质网应激[6]。本研究主要探讨了circ_0038467、miR-182对，Sp导的人肺泡上皮细胞系(HPAEpiC)凋亡和内质网应激的影响，分析了circ_0038467对miR-182的靶向调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺泡上皮细胞系(HPAEpiC)和肺炎链球菌(Sp)R6(中国科学院典型培养物保藏中心)；circ_0038467小干扰RNA、miR-182模拟物(mimics)、miR-182抑制物(anti-miR-182)、circ_0038467过表达载体以及各自对照和双荧光素酶载体(广州锐博公司)；Trizol试剂、miScript反转录试剂盒、miScript SYBR Green试剂盒、反转录酶、SYBR Green PCR master mix(北京天根生化公司)；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染法凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司)；羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗、兔源重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells，BIP)多克隆抗体、鼠源CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)单克隆抗体、兔源B细胞淋巴瘤(Bcl-2)单克隆抗体、兔源Bcl相关X蛋白(Bax)单克隆抗体、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)单克隆抗体、裂解的caspase-3(cleaved-caspase-3)单克隆抗体和兔源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(上海碧云天生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：用DMEM培养基(添加10%胎牛血清)培养HPAEpiC细胞，培养箱温度为37 ℃、CO2体积分数5%培养HPAEpiC。细胞汇合度达80%时进行传代。将对数期HPAEpiC细胞接种6孔板，细胞单层增殖至90%汇合时用1×108CFU/mL的肺炎链球菌R6培养细胞记为SP组[7]。正常对照(NC)组为正常培养的HPAEpiC细胞。Sp+si-NC组、Sp+si-circ_0038467组、Sp+miR-NC组、Sp+miR-182组、Sp+si-circ_0038467+anti-miR-NC组、Sp+si-circ_0038467+anti-miR-182组为在用Sp感染前48 h分别转染si-NC、si-circ_0038467、miR-NC、miR-182 mimics、si-circ_0038467+anti-miR-NC、si-circ_0038467+ anti-miR-182至HPAEpiC细胞。细胞转染参照脂质体Lipofectamine 2000使用说明进行。

1.2.2 RT-qPCR检测circ_0038467和miR-182表达：Trizol试剂提取总RNA。使用反转录酶、SYBR Green PCR master mix以GAPDH为内参检测circ_0038467表达量。使用miScript反转录试剂盒和miScript SYBR Green试剂盒以U6为内参检测miR-182表达量。2-ΔΔCt法表示目的基因相对表达水平。引物序列如下：circ_0038467上游5′-TCCCAGCTG ACCTAAAGTCAAT-3′，下游5′-TGGTGACATTGAGC AGGAAC-3′；GAPDH上游5′-GTCAGCCGCATCTTC TTTTG-3′，下游5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；miR-182上游5′-TTTTAGAGGTTTCGTTAATTTTTT C-3′，下游5′-CTCGATTCGAACCTAAACTCG-3′；U6上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGAT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTT-3′。

1.2.3 流式细胞测量术检测细胞凋亡：每组取5×105个HPAEpiC细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后重悬于100 μL结合缓冲液中。加入5 μL的FITC-annexin V孵育细胞10 min，再加入与5 μL的PI暗室内孵育细胞15 min。随后流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.2.4 蛋白印迹法(Western blot)检测内质网应激和凋亡相关蛋白表达：RIPA法提取HPAEpiC细胞总蛋白，二喹啉甲酸法测定总蛋白含量。在蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸5 min使其变性。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量变性蛋白，随后用脱脂牛奶封闭膜后，用1∶1 000稀释的BIP、CHOP、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved-caspase-3抗体分别孵育膜2 h，再用山羊抗兔二抗孵育膜1 h。化学发光试剂检测蛋白条带，ImageJ软件扫描分析吸光度值。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验：合成含有miR-182结合位点的野生型或突变型circ_0038467序列，将其插入pmir-GLO构建成野生型(WT)或突变型(MUT)circ_0038467双荧光素酶载体，该步骤由上海吉玛制药公司完成。用Lipofectamine 2000将WT/MUT-circ_0038467分别与miR-182 mimics、miR-NC共转染细胞，48 h后测定荧光素酶活性。相对荧光素酶活性以萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性的比值表示。同时将pcDNA-NC、pcDNA-circ_0038467、si-NC、si-circ_0038467分别转染HPAEpiC细胞，RT-qPCR检测转染48 h后miR-182表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肺炎链球菌感染对HPAEpiC细胞中circ_0038467和miR-182表达的影响

与NC组比较，Sp组HPAEpiC细胞中circ_0038467表达量显著增加(P<0.05)，而miR-182表达量显著降低(P<0.05)(表1)。

表1 Sp感染对HPAEpiC细胞中circ_0038467和miR-182表达的影响

2.2 抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡及内质网应激的影响

与NC组比较，Sp组HPAEpiC细胞circ_0038467表达量、凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表达量显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)；与Sp+si-NC组比较，Sp+si-circ_0038467组HPAEpiC细胞circ_0038467表达量、凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表达量显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)(表2,图1～3)。

图1 抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡的影响Fig 1 Effects of inhibition of circ_0038467 expression on HPAEpiC cell apoptosis induced by Sp

图2 抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡蛋白的影响Fig 2 Effect of inhibition of circ_0038467 expression on HPAEpiC cell apoptotic proteins induced by Sp

图3 抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞内质网应激蛋白的影响Fig 3 Effects of inhibition of circ_0038467 expression on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

表2 抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡及内质网应激的影响

2.3 Circ_0038467靶向调控miR-182的表达

生物信息学软件在线预测显示，circ_0038467与miR-182存在连续结合位点(图4)。双荧光素酶报告实验分析circ_0038467和miR-182靶向关系显示，野生型载体WT-circ_0038467细胞实验中miR-182组细胞荧光素酶活性较miR-con组显著降低(P<0.05)(表3)。pcDNA-circ_0038467组细胞中circ_0038467表达量显著高于pcDNA-NC组(P<0.05)，miR-182表达量显著低于pcDNA-NC组(P<0.05)；si-circ_0038467组细胞中circ_0038467表达量显著低于si-NC组(P<0.05)，miR-182表达量显著高于si-NC组(P<0.05)(表4)。

表3 双荧光素酶报告基因实验Table 3 Dual-luciferase reporter

表4 Circ_0038467调控miR-182的表达

图4 Circ_0038467序列中有miR-182结合序列Fig 4 There was a binding sequence of miR-182 in the circ_0038467 sequence

2.4 转染miR-182对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡及内质网应激的影响

与Sp+miR-NC组比较，Sp+miR-182组HPAEpiC细胞miR-182表达量显著升高，凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表达量显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)(表5,图5～7)。

表5 转染miR-182对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡及内质网应激的影响

图5 转染miR-182对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡的影响Fig 5 Effect of transfection miR-182 on apoptosis of HPAEpiC cell induced by Sp

2.5 干扰miR-182表达逆转抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞炎凋亡及内质网应激的影响

与Sp+si-circ_0038467+anti-miR-NC组比较，Sp+si-circ_0038467+anti-miR-182组HPAEpiC细胞miR-182表达量显著降低，凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表达量显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)(表6,图8～10)。

表6 干扰miR-182表达逆转抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡及内质网应激的影响

3 讨论

CircRNA是近年发现的非编码RNA，其异常表达在肺相关疾病、肿瘤中具有重要作用。肺癌组织中hsa_circ_100395表达水平与临床病理分期、转移呈负相关[8]。Hsa_circ_0044226高表达参与肺纤维化进展[9]。本研究发现Sp感染后circ_0038467表达量显著增加，提示circ_0038467可能与肺炎链球菌诱导的HPAEpiC细胞损伤相关。功能缺失实验显示，抑制circ_0038467表达显著减弱Sp诱导的细胞凋亡。Bcl家族蛋白是细胞凋亡通路的关键因子，制circ_0038467显著增加HPAEpiC中Bcl-2表达、降低Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3表达，与抗凋亡作用吻合。内质网主要负责蛋白质折叠和组装，当严重或有害刺激持续时间过长时导致蛋白质折叠和输出受到干扰，触发内质网应激[11]。本研究中抑制circ_0038467显著降低内质网应激标志物BIP和CHOP蛋白水平。这些结果表明抑制circ_0038467表达能够降低Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡和内质网应激。

图6 转染miR-182对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡蛋白的影响Fig 6 Effect of transfection miR-182 on apoptotic proteins of HPAEpiC cell induced by Sp

图7 转染miR-182对Sp诱导的HPAEpiC细胞内质网应激蛋白的影响Fig 7 Effect of transfection miR-182 on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

Bax表达增加移位线粒体可改变膜通透性，导致促凋亡蛋白释放，进而触发caspase-3蛋白激活诱导细胞凋亡，通过降低Bax表达、增加Bcl-2表达可减弱脂多糖诱导的肺泡上皮细胞凋亡[10]。本研究中抑miRNA是基因表达的关键转录后调节因子，其通过与靶mRNA结合抑制其表达在细胞存活、凋亡、炎性反应中发挥功能。大量研究表明，circRNA通过与miRNA结合进而在基因表达调控中发挥作用[12-13]。本研究证实miR-182是circ_0038467的下游靶点，且circ_0038467负调控miR-182表达。miR-182在多种器官组织的炎性损伤中发挥作用。骨髓源性间充质干细胞治疗显著提高LPS诱导的急性肺损伤大鼠模型中miR-182表达水平[14]。miR-182通过抑制Toll样受体4还可降低LPS诱导的巨噬细胞中促炎因子产生，改善肝脏缺血再灌注损伤[15]。Sp感染后HPAEpiC中miR-182表达量显著降低，提示miR-182可能对Sp诱导的HPAEpiC细胞损伤发挥保护作用。功能获得实验显示，转染miR-182 mimics显著降低Sp感染后HPAEpiC细胞凋亡率，降低Bax、BIP和CHOP蛋白表达，升高Bcl-2蛋白表达。此外，抑制miR-182表达显著减弱circ_0038467抑制对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡和内质网应激的保护作用。

图8 干扰miR-182表达逆转抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡的影响Fig 8 Effect of interference with miR-182 expression reversed inhibition of circ_0038467 expression on apoptosis of HPAEpiC cell inflammation induced by Sp

图9 干扰miR-182表达逆转抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡蛋白的影响Fig 9 Effect of interfering with miR-182 expression reversed inhibition of circ_0038467 expression on apoptotic proteins in HPAEpiC cell inflam- mation induced by Sp

图10 干扰miR-182表达逆转抑制circ_0038467表达对Sp诱导的HPAEpiC细胞内质网应激蛋白的影响Fig 10 Effect of interference with miR-182 expression and reverse inhibition of circ_0038467 expression on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

总之，本研究证实抑制circ_0038467通过靶向调控miR-182表达可减弱Sp诱导的HPAEpiC细胞凋亡和内质网应激。因此，靶向circ_0038467/miR-182可能成为肺炎治疗的重要策略。