羊源产气荚膜梭菌多重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

李一鸣，李 丽,2，张凯悦，张彦明*，姜艳芬*

(1.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.威海市文登区人才创新发展中心，山东 威海 264400)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种广泛分布于环境和动物肠道中的革兰阳性厌氧梭状芽孢杆菌，属于条件性致病菌[1-2]。当动物(机体)免疫力下降或环境剧烈变化引起应激时，可造成肠道菌群失调，产气荚膜梭菌迅速繁殖，产生的大量毒素损坏肠黏膜上皮细胞的完整性，使肠道黏膜的通透性增加，细菌和毒素进入血液循环，造成坏死性肠炎和肠毒血症等疾病[3-4]。该菌分为A～G 7个血清型[5]，其中A～E型引起羊发病，A型是引起羊“猝死症”的主要原因，产生α毒素；B型是羔羊痢疾和绵羊出血性肠炎的病原，产生α、β和ε毒素；C型引起绵羊、山羊、羔羊等肠毒血症，产生α和β毒素；D型引起山羊、绵羊肠毒血症，产生α和ε毒素；E型主要引起羔羊肠毒血症，产生α和ι毒素，我国目前还没有关于E型菌株分离的报道。

目前，产气荚膜梭菌病已广泛分布于全国各地，以潜伏期短、发病急、死亡快为特点，严重危害中国畜牧业的发展[6-7]。据青海省海北州祁连县绵羊发病死亡情况调查，平均3.9%的病死率中，致死率达到1.7%，接近绵羊发病死亡的50.0%[8]。近些年，随着养羊业不断向着集约化、规模化发展，该种疾病的报告病例呈上升趋势，急需采取有效措施，切实做好防控工作[9]。因此，建立一种快速鉴别诊断方法已迫在眉睫。本研究建立了针对A、B、C、D型羊源产气荚膜梭菌的α、β和ε毒素基因的多重荧光定量 PCR检测方法，定量检测不同型的产气荚膜梭菌，为更好地防控产气荚膜梭菌病，有效降低该类疫病的发病率提供科学支持。

1 材料与方法

1.1 试验菌株产气荚膜梭菌A型(CVCC49)、B型(CVCC54)、C型(CVCC59)、D型(CVCC84)，均购自中国兽医菌种保藏中心；链球菌(CVCC 1887)、沙门菌(CVCC2185)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、腐败梭菌(CVCC 60021)和金黄色葡萄球菌(ACCC 01011)均由西北农林科技大学兽医公共卫生实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器Premix Ex Taq 2×Probe qPCR购自宝生物(大连)公司；液体巯基乙醇酸盐培养基(FTG)和脑心浸出液肉汤培养基(BHI)购自北京奥博星生物公司；粪便、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)公司；CFX96 Touch实时荧光定量PCR系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 引物和探针的设计根据GenBank中收录的产气荚膜梭菌毒素基因序列，查阅并参考相关文献[10]，应用Primer 5.0软件分别设计了cpa、cpb和etx3种毒素基因特异性引物及TaqMan探针，由宝生物(大连)公司合成，引物及探针的序列、扩增长度见表1。

表1 荧光定量PCR引物及探针序列

1.4 阳性标准品的制备以B型产气荚膜梭菌为模板，进行cpa、cpb和etx基因目的片段PCR扩增及产物纯化回收。回收产物cpa与pMD18-T载体、cpb/etx与pGEM-T easy载体连接，转化至DH5α感受态细胞培养。通过蓝白斑筛选，挑取单克隆白色菌落进行PCR鉴定，检测阳性的送西安擎科生物公司测序。测序结果与克隆基因目的片段完全一致的阳性克隆接种Amp+LB液体培养基，提取质粒。根据计算公式：质粒拷贝数(拷贝/μL)= 阿氏常数×质粒质量浓度(g/μL)/质粒相对分子质量(g/moL)，进行质粒拷贝数浓度换算，-20℃保存备用，作为荧光定量PCR的标准品。

1.5 单项荧光定量PCR方法的建立将引物和探针均稀释为10 μmol/L(etx-Pr稀释为5 μmol/L)，引物和探针的加入量分别为0.5,1.0，2.0 μL，退火温度为53,54,55,56℃ 4个梯度，互相组合进行试验。对所得的每个浓度梯度的循环阈值(cycle threshold，Ct)进行比较，以产生Ct值最小和标准偏差最小值两者综合指数为依据选择最佳引物、探针浓度和退火温度。分别按照建立的单项荧光定量PCR反应条件进行敏感性、特异性及重复性试验。

1.6 多重荧光定量PCR方法的建立

1.6.1反应体系条件的确立 依据已优化的单项荧光定量PCR的引物浓度进行多重荧光定量PCR的引物和探针及退火温度的优化。

1.6.2敏感性试验 按照已建立的多重荧光定量PCR反应条件，以10倍梯度稀释制备成1×109～1×100拷贝/μL的质粒标准品为模板进行荧光定量PCR敏感性试验，每个样品重复3次，建立动力学扩增曲线和标准曲线。

1.6.3特异性试验 按照已建立的反应条件对产气荚膜梭菌A、B、C、D型菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希菌、腐败梭菌和金黄色葡萄球菌，以菌液为模板在相同条件下进行荧光定量PCR检测，观察反应的特异性。

1.7 基因组DNA和菌液荧光定量PCR敏感性检测提取B型产气荚膜梭菌DNA，测质量浓度后将其稀释为1 mg/L，再以10倍梯度稀释制备成1×10-1～1×10-9mg/L的DNA为模板，每个梯度重复3次进行扩增，检测其灵敏度；另取100 μL B型菌液倍比稀释8个梯度，以各梯度菌液为模板，每个梯度重复3次进行荧光定量PCR反应检测其灵敏度；同时分别吸取10-4～10-7梯度菌液各100 μL涂布TSC平板，每个梯度2个重复，37℃厌氧培养24 h后进行菌落计数，计算原始菌液浓度及各梯度DNA所对应的菌落数。

1.8 临床样品检测根据粪便基因组DNA提取试剂盒说明书，对采集的20份健康山羊粪便提取DNA，应用本研究建立的方法进行检测，同时，根据GB 4789.13—2012《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌》对样品进行菌落计数及分离鉴定[11]，计算符合率，验证该方法的实用性。

2 结果

2.1 阳性标准品的制备PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在137,113,133 bp处分别有1条特异性条带，扩增结果与设计的目的片段长度相符(图1)。经纯化回收、连接转化、PCR鉴定，测序鉴定的阳性克隆接种Amp+LB液体培养基，提取质粒。测定质粒质量浓度：cpa-pMD18-T为259.12 mg/L，cpb-pGEM-T为243.86 mg/L，etx-pGEM-T为114.90 mg/L。计算的重组质粒拷贝数分别为8.35×1010,7.11×1010,3.33×1010拷贝/μL。将质粒标准品-20℃ 保存备用，同时将质粒的一部分稀释制备成1×109～1×100拷贝/μL的质粒标准品。

M.DL2000 DNA Marker;1～2.cpa;4～5.cpb；7～8.etx;3,6,9.阴性对照

2.2 单项荧光定量PCR方法的建立

2.2.1反应体系条件的确立 经优化，最终确立的单项荧光定量PCR引物和探针的最佳浓度分别为cpa-F/R/P 0.4 μmol/L，cpb-F/R/P 0.8 μmol/L，etx-F/R 0.4 μmol/L，etx-P 0.2 μmol/L。退火温度为55℃。反应程序同多重荧光定量PCR。

2.2.2敏感性和标准曲线的建立 敏感性试验结果显示，最低检测限均为1×102拷贝/μL，除cpa-pMD18-T的1×101拷贝/μL有扩增曲线和荧光信号外(但Ct>36)(图2B)，其他1×101～1×100拷贝/μL均无扩增曲线和荧光信号(图2D，2F)。cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T的扩增效率分别为101.1%，91.6%，102.0%，R2分别为0.998，0.998，0.999(图2A,C,E)。

2.2.3特异性与重复性 结果显示，在有效循环内除了以1×1010拷贝/μL标准品为模板的PCR反应起峰外，以链球菌、沙门菌、大肠埃希菌、腐败梭菌和金黄色葡萄球菌菌液为模板和阴性对照的PCR反应均无扩增曲线出现。通过计算，批内和批间重复试验的CV值均小于4%。

A,B.蓝色为cpa-pMD18-T;C,D.绿色为cpb-pGEM-T;E,F.橙色为etx-pGEM-T

2.3 多重荧光定量PCR方法的建立

2.3.1反应体系及条件的确立 经优化，最终确立的多重荧光定量PCR反应体系：Premix Ex Taq 2×Probe qPCR 12.5 μL，cpa-F/R/P(10 μmol/L)各1 μL，cpb-F/R/P(20 μmol/L)各1 μL，etx-F/R(20 μmol/L)各0.5 μL，etx-P(5 μmol/L)1 μL，cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T、etx-pGEM-T各1 μL，最后用ddH2O将反应体积补至25 μL。反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 s，40个循环；在退火阶段检测荧光信号。

2.3.2敏感性和标准曲线的建立 多重荧光定量PCR敏感性试验结果显示，最低检测限均为1×102拷贝/μL，除etx-pGEM-T的1×101拷贝/μL有扩增曲线和荧光信号外(但Ct>36)，其他1×101～1×100拷贝/μL均无扩增曲线和荧光信号(图3B)。结果与单项荧光定量PCR基本一致。cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T的扩增效率分别为95.0%，91.2.%,101.3%，R2分别为0.990，0.991,0.999(图3A)。

a.cpa-pMD18-T；b.cpb-pGEM-T；c.etx-pGEM-T

2.3.3特异性 多重荧光定量PCR特异性检测结果显示，A(α毒素)、B(α、β和ε毒素)、C(α和β毒素)、D(α和ε毒素)型产气荚膜梭菌均出现cpa扩增曲线，同时B型菌出现cpb和etx2条扩增曲线，C和D型菌分别出现cpb和etx扩增曲线，以其他常见细菌菌液为模板和阴性对照的PCR反应均无扩增曲线出现(图4)，说明该方法具有良好的特异性。

1.cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T；2.A型菌；3.B型菌；4.C型菌；5.D型菌；6.ddH2O；7.链球菌；8.沙门菌；9.大肠埃希菌；10.腐败梭菌；11.金黄色葡萄球菌

2.3.4重复性 通过计算，批内重复试验cpa、cpb和etx的CV值分别为0.27%～0.85%,1.02%～2.08%,1.23%～2.26%。批间重复试验cpa、cpb和etx的CV值分别为0.44%～1.88%,1.00%～2.30%,0.44%～2.08%。以上CV值均小于4%，说明该方法具有良好的重复性。

2.3.5菌液和基因组DNA荧光定量PCR敏感性检测 荧光定量PCR检测结果显示，B型菌液稀释至5.0×106～5.0×102CFU/mL，具有较好扩增曲线及线性关系，因此，其检测限为5.0×102CFU/mL。cpa、cpb和etx的扩增效率分别为101.5%，94.8%,92.1%，R2分别为0.994，0.997,0.999(图5A，B)。基因组DNA稀释至1.0×100～1.0×10-4mg/L，其对应的菌落数为2.91×106～2.91×102CFU/mL，具有较好的扩增曲线及线性关系，因此，其检测限为100 μg/L和2.91×102CFU/mL。cpa、cpb和etx的扩增效率分别为82.3%,73.4%,79.6%，R2分别为0.999,0.996,0.999(图5C，D)。

2.3.6临床样品检测 荧光定量PCR结果显示，20份样品中16份样品检测到cpa，其中2份样品检测到etx，B型DNA作阳性对照扩增出cpa、cpb和etx，其他样品cpa、cpb和etx均为阴性(图6)。D型菌株DNA标准曲线显示cpa比etx的Ct值大1.7左右，etx的表达量高于cpa。然而，2份样品出现etx的Ct值大于cpa，cpa的表达量高于etx，推测样品中既含A型又含D型菌。根据B型标准曲线，计算出样品中产气荚膜梭菌菌落数为102～104CFU/g，2份含D型菌样品的A和D型菌菌落数均为102CFU/g，与菌落计数结果相比符合率达90%。样品经分离纯化，阳性分离率为80%且均为A型菌，与荧光定量PCR结果相比，1株荧光定量PCR检测阳性但细菌分离鉴定结果为阴性，另有1株细菌分离鉴定为阳性但荧光定量PCR检测为阴性，因此，该符合率为90%。说明此方法有良好的实用价值，且方便快捷可对羊源产气荚膜梭菌进行分型及定量检测。

A.菌液标准曲线；B.菌液敏感性；C.DNA标准曲线；D.DNA敏感性(蓝色.cpa；绿色.cpb；橙色.etx)

1～3.B型DNA cpa、cpb、etx扩增曲线；4.阳性粪便样品；5.阴性粪便样品和阴性对照

3 讨论

产气荚膜梭菌不仅能引起多种动物的多种疾病和造成家畜的大量死亡，而且也直接危害着人类的健康。目前，已知羊源产气荚膜梭菌主要引起羔羊和幼龄羊患病，对其他年龄段的羊只也有影响，但症状并不严重，虽然该病的发病率较低，但病死率却很高。尽管接种疫苗大大降低了该病的发病率，但该病仍经常发生[12]，给我国养羊业造成了严重的经济损失，严重危害我国畜牧业的健康发展。

现阶段关于产气荚膜梭菌的检测方法主要包括多重PCR、LAMP、荧光定量PCR等[13-15]，但多重PCR检测耗时长、流程较繁琐，LAMP需要设计多条特异性引物、且易产生假阳性。而TaqMan荧光定量PCR技术是一种拥有较多优势的分子生物学方法，既可定性又可达到定量的目的。因此，建立针对A、B、C、D型羊源产气荚膜梭菌的α、β和ε毒素基因的多重荧光定量PCR检测方法。该方法可在1个体系内同时对96个样品进行3个毒素的检测，在临床中，对液体样品(饮水、污水或羊奶等)或经初步FTG厌氧培养的样品直接检测，固体样品(粪便或饲料等)可提取总DNA后检测[16]，依据建立的菌液和基因组DNA标准曲线，对样品实现实时定量监测。

本研究建立的荧光定量方法在敏感性方面，cpa、cpb和etx质粒拷贝数均可达1×102拷贝/μL(3.1×10-7mg/L)，而张蓉蓉等[17]建立的方法检测限为1.5×10-5mg/L。菌液检测限为5.0×102CFU/mL，DNA检测限为100 μg/L，WISE等[18]建立的实时荧光定量PCR的灵敏度为50 μg/L，与本实验室建立的多重PCR检测方法的灵敏度(2.6×104CFU/mL)相比提高了100倍[13]。试验结果表明，该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。

应用建立的多重荧光定量PCR方法，在采集的20份健康山羊粪便样品中，14份检测到A型，2份检测到既含A型又含D型菌。然而，经分离纯化鉴定均为A型菌。传统分离鉴定方法虽无灵敏度限制，只要样品中含目的菌，就可检测到，但纯化过程由于只挑取单个菌落，存在漏检情况，导致最终结果不准确，同时，样品菌落计数需要进行厌氧培养24 h以及菌落的鉴定，耗时长，过程繁琐。本研究建立的方法可以弥补传统方法存在的弊端，不仅准确快速地对样品中产气荚膜梭菌进行分型，而且可以实时监测。该方法不仅为产气荚膜梭菌引发疾病的生物安全提供快速便捷的技术支持，也为这些疾病的临床检测提供辅助手段。