肺微浸润性腺癌患者癌组织中基因突变情况观察

王露，孙怡，赵苏苏，陈思敏，章宜芬

江苏省中医院病理科，南京210000

肺微浸润性腺癌（MIA）是直径≤3 cm的单个腺癌［1］，以贴壁型为主，浸润灶≤0.5 cm［2-3］。随着CT等影像学检测手段的普及，肺MIA的检出率越来越高。目前，肺MIA发生的原因尚不明确，有关其分子病因学方面的研究更是有限［1］。我们对86例肺MIA的癌组织进行肺癌基因高通量测序检测，分析了其基因突变情况，并分析了不同临床特征患者癌组织基因突变情况，为肺MIA的病因探讨提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料经江苏省中医院伦理委员会同意批准，收集本院2018年5月—2020年8月行手术治疗的肺MIA患者86例，均经病理检查确诊，男20例、女66例，年龄18～80岁、中位年龄52岁。既往有肺内肿瘤病史2例，均是肺MIA；有肺外肿瘤病史16例，其中子宫肌瘤7例、乳腺癌4例、甲状腺乳头状癌3例、垂体肿瘤1例、膀胱癌1例、阑尾肿瘤1例。有肺炎病史8例，有吸烟史6例。患者直系血缘亲属有肺癌病史10例，其中有肺癌病史者祖父1例、外祖母和母亲1例、父亲3例、母亲3例，父亲和母亲都有1例，患者承认有但不愿告知具体情况1例；患者直系血缘亲属无肺癌病史41例。多数肺MIA患者没有明显的临床症状，有14例患者影像学检查前有一些非特异的呼吸道症状，如干咳、咳痰、胸闷、胸痛、气喘等。术前胸部CT检测：多发结节45例，单发结节35例；磨玻璃结节62个，其中23个为混杂磨玻璃结节、35个为纯磨玻璃结节、4个为实性结节。58例纵隔未见肿大淋巴结，仅有5例患者纵隔有肿大淋巴结，20例未查到纵隔淋巴结影像学结果。手术标本类型：肺结节楔形切除标本76例份，肺段切除标本7例份，肺叶切除标本3例份。结节位置：右上肺30例，右中肺3例，右下肺17例，左上肺20例，左下肺17例。结节镜下最大径0.4～1.8 cm、中位数为0.8 cm；微小浸润灶最大径0.1～0.5 cm、中位数0.2 cm。病理类型均为非黏液型。患者均未见肺膜及脉管、神经侵犯。病理分期参照AJCC第八版分期，均为ⅠA1期。

1.2 肺MIA癌组织基因型分析手术切除标本经甲醛固定，取材医师取材，制成石蜡标本，并切片染色，制成HE切片。选择有肺MIA的癌组织，使用世和定制肺癌基因检测试剂盒，在Illuminia Hiseq高通量测序平台进行肺癌基因高通量测序。具体步骤如下：由两名病理医师（一名主治医师和一名副主任医师）镜下明确肺MIA的诊断，并进行显微切割，获取富集MIA的石蜡组织；然后使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒从富集MIA的石蜡组织中提取基因组DNA。用Qubit荧光计（ThermoFisher，美国）测定提取的基因组DNA浓度；选取1～2 mg DNA使用Hiseq PE Cluster Kit Box1/2构建文库。然后使用Hiseq SBS kit 300 Cycles Box1/2富集扩增子，继而在Illuminia Hiseq高通量测序平台测序。测序结果在生物信息学分析软件（世和基因GSCAP pipeline）上进行比对分析。共检测15个基因全外显子、部分融合相关内含子区域、可变剪切区域（覆盖所有NCCN指南推荐的肺癌靶向用药靶点），这些基因包括EG‑FR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、MET、Her-2、AKT1、MAP2K1（MEK1）、NRAS、NF1、PIK3CA、PTEN、RET、TP53。

1.3 统计学方法采用SPSS20.0统计软件。计数资料以率、百分比表示，根据最小理论频数值和标本数量不同分别行χ2检验、连续校正χ2检验及Fisherχ2检验，根据二项分布法计算各种基因突变率的95%置信区间（CI）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 86例肺MIA患者癌组织中基因突变情况86例患者中，癌组织有基因突变80例。有12种基因发生了突变：EGFR基因突变38例（44.19%）、95%CI33.48%～55.30%，ERBB2基 因 突 变18例（20.93%）、95%CI12.90%～31.05%，KRAS基因突变8例（9.30%）、95%CI4.10%～17.51%，MAPK21基因突变8例（9.30%）、95%CI4.10%～17.51%，BRAF基因突变7例（8.14%）、95%CI3.34%～16.05%，EML4-ALK融合基因3例（3.49%）、95%CI0.73%～9.86%，PIK3CA基因突变2例（2.33%）、95%CI0.28%～8.15%，TP53基 因 突 变2例（2.33%）、95%CI0.28%～8.15%，KIF5B-RET融合基因1例（1.16%）、95%CI0.03%～6.31%，KIF5BALK融 合 基 因1例（1.16%）、95%CI0.03%～6.31%，PTEN-IGR融合基因及IGR-RET融合基因1例（1.16%）、95%CI0.03%～6.31%。14例患者同时有1个以上的突变。

2.2 不同临床特征的肺MIA患者癌组织基因突变率比较不同临床特征［病灶部位（左侧或右侧）、性别（男性或女性）、肺小结节术前影像学表现（是否是磨玻璃结节、多发或单发、是否有淋巴结肿大）、是否有肺炎病史、术前是否有临床症状］的肺MIA患者癌组织基因突变率比较，P均＞0.05，见表1。

表1 不同临床特征的肺MIA患者癌组织中基因突变情况（例）

无肺癌病史的肺MIA患者癌组织中ERBB2突变18例、无突变66例；有肺癌病史的肺MIA患者癌组织中ERBB2突变1例、无突变1例。有无肺癌病史的肺MIA患者癌组织ERBB2基因突变率比较，P＜0.05。直系亲属有肺癌病史的肺MIA患者癌组织中EGFR突变8例，无突变2例；直系亲属无肺癌病史的肺MIA患者癌组织中EGFR突变15例，无突变24例；直系亲属中有无肺癌病史的肺MIA患者癌组织中EGFR突变率比较，连续矫正χ2=3.972，P＜0.05。其他基因改变与是否有肺癌病史、是否吸烟、直系亲属是否有肺癌病史均无关（P均＞0.05）。

3 讨论

近年肺MIA的发生率越来越高，虽然目前发现肺MIA的存活率近100%，但是还是存在一定复发率［4-7］。为明确肺MIA的发病原因，本研究对肺MIA癌组织行肺癌基因高通量测序，结果显示93.0%的患者有基因突变，只有7.0%的患者未检测到基因突变，但并不排除这些患者可能会有本研究检测基因以外的基因改变。本研究检测的15个基因中，有12个基因发现有突变，其中最常见的是EGFR（44.19%），其次是ERBB2（20.93%）；在具体突变类型中，最常见的是ERBB2（HER2）基因第20外显子发生非移码插入突变（出现19次，占19.59%），其次是EGFR基因第21外显子错义突变（L858R，出现18次，占18.56%），第三是EGFR第19外显子非移码缺失突变（出现11次，占11.34%）；提示肺MIA的发生与EGFR和ERBB2相关，这两种基因可能是肺腺癌发生的最早期分子事件。

ERBB2（同义词：HER2）是EGFR家族的成员［8］。有研究表明，ERBB2基因在非小细胞肺癌中，2%发生扩增［9］，2%～4%发生基因突变［10］。目前发现只有腺癌这一组织学类型才发生这种基因突变，并且主要是外显子20的插入和重复。ERBB2扩增和ERBB2突变互不相关［11］。目前已有研究发现，部分ERBB2突变的肿瘤患者对广谱ERB抑制剂阿法替尼敏感［12］。本研究发现，肺MIA中最常见的基因突变类型是ERBB2基因第20外显子发生非移码插入突变，与文献报道一致。本研究还发现，ERBB2基因突变的发生与是否有肺MIA病史有关，在有肺MIA病史的人群中ERBB2的突变发生率较高（50%vs.21.43%），提示有这类突变的患者需要密切随访，以便在再次复发或疾病进展时能及时治疗。对于多发、反复复发的肺MIA患者或者手术无法完全切除的患者，也许可以考虑使用ERB抑制剂治疗。

EGFR是一种跨膜蛋白，具有胞质内酪氨酸激酶结构域［13］。目前已有研究表明，西方肺腺癌患者的EGFR突变率为19%，亚洲肺腺癌患者的EGFR突变率为48%［14］。突变携带者主要是非吸烟者、女性和年龄较小的人群［15］。尽管在EGFR基因中检测到超过200种不同的突变，但最常见的两种突变是EG‑FR19外显子的缺失突变和21外显子的点突变（L858R），这两种突变占所有EGFR突变的85%～90%［16］。这些突变被称为激活或致敏突变，对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼敏感［16］。本研究中，第二常见的突变是EGFR基因第21外显子错义突变（L858R，出现18次，占18.56%），第三是EGFR第19外显子非移码缺失突变（出现11次，占11.34%），总体趋势与文献报道类似。发生EGFR突变患者中女性占73.5%，非吸烟者占91.8%，平均年龄51.51岁，提示EGFR突变的肺MIA患者主要是女性、非吸烟者人群。这两种突变都属于激活突变，导致EG‑FR的激活，继而同二聚体或异二聚体（与其他HER成员）形成、特异性酪氨酸残基的磷酸化和细胞内信号传导，细胞内信号反过来导致细胞增殖增加、迁移增加，细胞死亡减少［17］，提示这类基因突变可能参与了肺MIA的发生发展，并且与靶向药物治疗敏感性有关。

虽然吸烟和空气污染被认为是最重要的肺癌危险因素，但是已有研究证实某些基因胚系突变与肺癌的遗传易感性相关［18-19］。其中EGFR-T790M胚系突变被证实有遗传易感性［20-21］。本研究中肺MIA患者直系亲属有肺癌病史的仅占19.6%，绝大部分患者直系亲属没有肺癌病史。经统计学分析，发现EGFR突变与直系亲属肺癌病史有一定关系，显示直系亲属无肺癌病史者发生EGFR的突变频率相对较高，且这些直系亲属有肺癌病史的患者均未发现有EGFR-T790M突变。其他基因突变均未发现与直系亲属的肺癌病史有关。我们推测直系亲属无肺癌者发生EGFR突变者多，可能的情况有：直系亲属有肺癌的患者可能存在其他的易感基因多态性，这些基因多态性有可能与EGFR突变是互斥的关系；这需要进一步大样本研究证实。

本研究结果显示，不同临床特征［包括病灶部位、性别、肺小结节术前影像学表现（是否是磨玻璃结节、多发或单发、是否有淋巴结肿大）、是否有肺炎病史、术前是否有临床症状］的肺MIA患者癌组织中基因突变率比较无统计学差异，提示肺MIA的基因突变不受临床因素的影响。而本研究中肺MIA患者的年龄在49.21岁左右，其中24.4%在40岁以下，54.7%的患者在50岁以上；提示肺癌越来越年轻化，早期发现及诊断尤其重要，早期发现肺MIA并及时手术切除可获得100%无病生存率。本研究中虽然发现性别与基因突变发生无统计学差异，但肺MIA中女性患者居多，而且这些女性患者大部分没有吸烟史，仅部分认为自己有被动吸烟史（25.8%）；提示肺MIA的发生与吸烟史无关，可能与其他的因素（如：女性会更容易进行CT体检所以检出率高［4］、环境、心理等）相关。

综上所述，肺MIA癌组织易发生基因突变，其中最常见的是EGFR及ERBB2基因突变。有肺癌病史的肺MIA患者，癌组织中ERBB2突变发生率相对较高；直系亲属无肺癌病史的患者癌组织中发生EGFR突变相对较多。