甜菜多胚种质资源育性组成的分子标记分析

石好琪，吴则东，兴旺，丁刘慧子，邳植

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）为藜科甜菜属的二年生草本植物[1]，其产糖占据了世界蔗糖供应量的20%左右[2]，是除甘蔗以外的第二大糖料来源。因为甜菜是无限花序作物，所以人工去雄这种途径不可取[3]。甜菜要想利用杂种优势，不育系和保持系的利用是必不可少的，这就使得对甜菜的雄性不育系和保持系快速鉴定和选育显得尤为重要。选育甜菜优良品种就必须有优良不育系和授粉系，而选育甜菜不育系是甜菜育种中技术含量最高的环节之一。选育不育系的关键在于选育相应的保持系。选育甜菜保持系的方法目前主要为鉴定法。鉴定法是利用已有的不育系与待鉴定的个体进行成对杂交，而后观察后代育性情况，若全为不育系则待测个体即为保持系。程大友等人[4]利用鉴定法用时15个月左右成功鉴定出了甜菜保持系。虽然鉴定法鉴定甜菜保持系耗时相对较短，而分子标记鉴定甜菜育性具有更加省时、方便快捷的优点。如HAGIHARA 等[5]利用两个RAPD标记很好地区分出来甜菜不育和完全可育株。孟祥雯[6]依据甜菜叶片DNA 及花蕾cDNA多态性，得到甜菜‘DY5’品系保持系和不育系基因组、转录组并分析其差异。刘一珺[7]根据设计出的29对引物进行筛选得出7对引物所在甜菜不育系和保持系之间具有差异，至于这7对引物在其它甜菜品系的不育系和保持系中是否同样适用需要进一步验证。赵丽梅等人[8]利用412 对SSR 引物对大豆RN 型不育系‘YA’和恢复系‘167’杂交的F2分离群体进行筛选，获得了Satt414、Satt596 和Satt547 分子标记，通过这些分子标记可以提高大豆恢复系选育速度和效率，并且可为进一步精准定位恢复基因和克隆恢复基因打下基础。李志宽等人[9]通过对小麦的196对SSR引物进行扩增筛选，得出7个SSR分子标记在‘矮抗58’和‘R113’的F2代分离群体中的极端可育株和极端不育株的恢复池与不育池中扩增出了稳定的多态性差异条带，这7 个SSR 标记可直接用于T型或者S 型杂交小麦分子标记辅助育种，能有效提高相应恢复系的选择效率。赵丽梅等人[8]和李志宽等人[9]利用SSR分子标记对大豆、小麦的恢复系辅助选育研究，为我们应用SSR分子标记在甜菜不育系和保持系的鉴定提供了新思路。

大量可变数目的串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）存在于真核生物基因组中[10]，这些序列与多个基因座杂交并且本质上是可变的，因此被证明对遗传分析非常有用[11-12]。甜菜线粒体基因组中有4 个不相关联的串联重复位点（TR1、TR2、TR3 和TR4），而其中TR1 串联重复序列的多态性最高，拷贝数从2～13 个不等。可以利用作用于甜菜线粒体VNTR 位点的细胞质鉴定引物TR1 进行甜菜细胞质类型鉴定[13]，再利用甜菜细胞核DNA 的bvORF17上游区的多态性鉴定细胞核育性恢复基因（Rf1）的基因型就可以快速了解甜菜的育性组成情况[14]。本研究通过分子标记的手段了解国家甜菜种质资源库中甜菜多胚种质资源的细胞质类型以及细胞核育性恢复基因组成情况，为将来应用多胚保持系同步改良单胚不育系和保持系以及应用多胚保持系做父本更好地进行品种保护打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）供试种质：试验材料为国家甜菜种质资源库中的627份甜菜多胚种质资源，6份甜菜不育系和6份甜菜保持系种质资源。（2）引物：引物包括鉴定细胞质育性的TR1引物[15]和鉴定细胞核育性的T1、T2引物[14]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。（3）试验试剂与仪器：异丙醇、液氮、CTAB缓冲液、异戊醇、无水乙醇、2×Rapid Taq Master Mix、荧光核酸染料、琼脂糖、1×TAE 缓冲液。仪器：震荡研磨机、高速离心机、PCR 仪、凝胶成像仪、紫外分光光度计等。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

DNA 提取采用CTAB 法对甜菜种质资源嫩叶进行提取[16]，每份种质资源随机选取5 株进行混合取样。提取完DNA后放于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR扩增

对甜菜细胞质类型和细胞核Rf1位点基因型鉴定用引物1、引物2及PCR扩增体系如表1，PCR扩增条件如表2。

表1 甜菜细胞质类型和细胞核Rf1 位点基因型鉴定的PCR 扩增体系Table 1 PCR amplification system for genotype of cytoplasmic type and nucleus Rf1 locus in sugar beet

表2 甜菜细胞质类型和细胞核Rf1 位点基因型检验的PCR 扩增条件Table 2 PCR amplification conditions for genotype of cytoplasmic type and nucleus Rf1 locus in sugar beet

1.2.3 电泳

PCR 扩增结束后，吸取5µL 产物点入1%琼脂糖胶孔中，而后在130 V 电压下电泳30 min。电泳结束后利用凝胶成像仪进行条带观察。

2 结果与分析

2.1 甜菜细胞质类型鉴定

NISHIZAWA 等人[15]在甜菜的线粒体基因组中发现了4 个不相关联的串联重复位点TR1、TR2、TR3 和TR4，其中TR1 位点的多态性最高，串联重复序列的数量从2～13 个不等。王有昭[17]用TR1 引物对甜菜主要品系进行扩增，而后测序发现，不育系扩增条带大小在500 bp左右，保持系扩增条带大小在750 bp左右。鉴于此，我们可以通过对比条带大小判断甜菜细胞质类型。

通过对627 份甜菜多胚种质资源进行育性组成情况分析，TR1 引物扩增出来的条带类型有500 bp、750/500 bp（既有500 bp 条带也有750 bp 条带）、750 bp 和X 型（未知带型）4 种，即S 型细胞质（不可育细胞质类型）、N/S型细胞质类型（既有可育细胞质类型也有不可育细胞质类型）、N型细胞质（可育细胞质类型）和X型细胞质（未知细胞质类型）。其中N 型有234 份，占37%左右；N/S 型53 份，占8%左右；S 型289 份，占46%左右；X 型51 份，占8%左右，如表3。部分扩增结果如图1。X 这种带型在李士龙[18]、王良[19]的试验中均有出现。可以肯定的是这种带型在TR1位点拷贝数上有别于N 型和S型细胞质。为了进一步说明不育系的细胞质类型为S，选取6 株不育系和保持系进行验证，结果如图2。图2A 中出现的500 bp 左右的条带即为不育系所扩增出来的带型，图2B中出现的750 bp左右的条带即为保持系所扩增出来的带型。

表3 甜菜种质资源细胞质类型鉴定Table 3 Identification of cytoplasmic types of sugar beet germplasm resources

图1 甜菜多胚种质资源细胞质类型鉴定Fig.1 Identification of cytoplasmic types of sugar beet polyembryonic germplasm resources

图2 6份不育系（A）和6份保持系（B）细胞质类型鉴定Fig.2 Identification of cytoplasmic types of six sterile lines(A)and six maintainer lines(B)

2.2 甜菜细胞核Rf1位点基因型鉴定

利用T1、T2 引物对DNA 模板进行扩增，共扩增出来同时具有1 300 bp 和1 800 bp 以及仅具1 800 bp 两种带型，甜菜种质资源基因型鉴定结果如图3。刘一珺[7]在用T1、T2引物进行扩增时扩增出来3种带型，而本次试验中没有单一1 300 bp 这种带型。试验中，用TR1 引物扩增出来的627 份DNA 模板进行细胞核基因型验证，其中同时具有1 800 bp 和1 300 bp 两种条带有78份，仅具1 800 bp条带有159 份，有390 份没有扩增出条带。根据刘一珺[7]对甜菜用T1、T2 引物扩增，得出T1、T2 引物共扩增出来1 800 bp、1 300 bp 和1800/1300 bp 三种条带带型。本试验有部分种质资源尽管用TR1 引物能扩增出来N 或者S 型条带，但T1、T2 引物却扩增不出来相应的条带（表4）。

图3 甜菜多胚种质资源细胞核Rf1位点基因型鉴定Fig.3 Genotype identification of nucleus Rf1 locus in sugar beet polyembryonic germplasm resources

表4 甜菜种质资源育性组成情况统计Table 4 Statistics of fertility composition of sugarbeet germplasm resources

然后采用6 个不育系进行细胞核的基因型验证。扩增结果如图4。结果均为1 800 bp 条带。结合细胞质类型的验证，可以判断不育株的细胞质基因型为S 型，但细胞核Rf1位点的基因型还需进行酶切验证进一步确认。

图4 6份甜菜不育系细胞核Rf1位点基因型鉴定Fig.4 Genotype identification of nucleus Rf1 locus in six sugar beet sterile lines

3 讨论与结论

利用分子标记对甜菜育性进行鉴定具有很大的实际意义[20]，以往鉴定甜菜不育系和保持系都耗时较长，而且一旦某个环节出现问题就前功尽弃。通过T1、T2引物扩增出来的条带而后进行酶切验证可以判断细胞核Rf1位点基因型，若细胞质类型为N或者S 型就可以判定其为保持系或者不育系。有部分种质资源用T1、T2 引物没有扩增出来结果，推测其产生的原因为：(1)模板发生降解，导致引物所扩增位点不存在；(2)T1、T2引物的扩增位点突变，导致引物无法与相应区域结合。在细胞质育性鉴定时出现了N/S型细胞质带型，这是由于采样时混样造成的。因此，若是想进一步了解甜菜种质资源整体育性情况，采取抽样调查，单株鉴定是一个更为可行的方式。

1945 年，欧文提出X和Z基因座的互补作用控制甜菜的雄性不育或可育[21]，后来他又指出这种遗传模型并不能解释他所做的所有杂交结果。1950年，欧文又提出X 基因座上的育性恢复基因X（即Rf1基因）对于甜菜的育性恢复起到至关重要的作用，而Z基因座对甜菜育性恢复的影响较小[22]，因此鉴定Rf1基因型对于甜菜的育性鉴定至关重要。MORITANI 等人[23]在研究中建立了两个分子标记，这两个分子标记可以在甜菜群体中对保持系基因型进行简单而快速的分析，尽管最终确认仍需进行试验杂交，但这两种DNA 标记的预选择可以减少保持系选择的规模。因为可以在苗期就进行筛选，所以使用这种新的标记系统将大大减少这一作物品种育种计划所需的劳动力，但该分子标记方法的一个局限性是标记系统不能完全准确有效地识别每一个保持系。目前，甜菜细胞质育性基因型已经可以用分子标记很好地区分出来[15]，细胞核的Rf1位点基因型通过分子标记也能很轻易区分出来[14,24-25]。在对细胞核基因型进行鉴定时，刘一珺[7]利用TAGUCHI等人[14]所述的引物对甜菜基因组DNA进行扩增时产生了3种带型，而其中的1 800 bp大小的带型经过酶切后的4/4模式带型和保持系带型吻合，而另外两种带型却不确定具体的基因型，因此，这两种带型是否也对应相应的甜菜细胞核基因型需要结合分子标记和田间试验进一步探究。未来，利用分子标记准确地确定每一株甜菜的育性情况对于以后的甜菜育种工作具有重要意义。

在用TR1 引物对甜菜DNA 模板进行扩增时，出现严重的弥散现象。起初进行退火温度的调整，但去除效果不明显。后把循环数调整为25，弥散现象才基本消除，但仍然有个别弥散现象，疑似人为加样时导致DNA 模板未能加入。另外，在扩增结果中出现了N/S型（即有750 bp 的条带，也有500 bp的条带）的现象，这是由于混合取样造成的，这种N/S双带型表明样品中既有可育细胞质类型也有不育细胞质类型。

试验通过对国家甜菜种质资源库中的部分甜菜种质资源进行育性鉴定表明，627 份种质资源中不育型细胞质类型占46%左右，可育型细胞质类型占37%左右。对于T1、T2 引物扩增条带为1800/1300 bp 的种质资源是否是1800/1300 bp型或者1 800 bp 和1 300 bp型的混合仍未可知。但从总体来看，国家甜菜种质资源库中的资源育性程度较复杂，在后续育种中需要对其进行单株筛选。