红甜菜提取物及甜菜红素的体外抗氧化活性分析

王锦霞，郭萌萌，刘亚昕，闫桦，孙思琦，王秋红，兴旺，刘大丽

（1.国家甜菜种质中期库/黑龙江大学，哈尔滨 150080；2.黑龙江大学现代农业与生态环境学院/黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨 150080；3.黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150080）

0 引言

红甜菜为藜科甜菜属甜菜种的一个变种，与广泛种植的糖用甜菜相比，生物学特性比较相似，但所含营养物质成分差异较大[1]。经现代研究表明，红甜菜含有极其丰富的营养价值，其营养成分为：可溶性蛋白、可溶性糖、游离不饱和脂肪酸、维生素C、烟酰胺、膳食纤维、甜菜碱、皂苷类和种类丰富的人体必需微量元素以及甜菜色素[2]。较多研究表明，红甜菜具有抗癌、降血脂、降血压、降血糖、抗氧化、降低细胞毒性等功能[3-5]。故红甜菜在工业、商业及食品领域具有广阔的应用前景和市场。

红甜菜中的色素作为一种天然色素，不仅有极高的营养价值而且安全性高，还可以替代人工合成染料，作为食品色素或添加剂被广泛应用在各个行业中[6]。甜菜红素是红甜菜中所有有色物质的总称，分为甜菜花青素和甜菜黄素两种，是水溶性杂环酪氨酸衍生物，其主要成分为甜菜红苷，占甜菜红素的75%～90%[7-8]。甜菜红素在其他植物或者真菌中也有分布，但在红甜菜中的含量显著高于其他物种[9]。甜菜红苷是甜菜红素清除自由基的主要基团，甜菜红苷的功能性基团既是电子供体又是电子受体，作为氧化还原的中间体[10]。红甜菜块根中的甜菜红素能够显著提高细胞中SOD、CAT、MDA等具有抗氧化功能活性物质的含量，在生理状态下具有较强的抗氧化和抗癌能力，可有效地缓解高血脂症、冠心病、糖尿病等[11-12]。其所含丰富的维生素C、烟酸、皂角苷类以及矿物质等也具有一定的保健功能和营养价值。同时，红甜菜叶片也具有较强的抗氧化能力，并且其抗氧化性能与多酚、花青素、类胡萝卜素、叶绿素等色素呈显著正相关[13]。

虽然通过高效液相色谱法可测定红甜菜中甜菜红素的含量，但是至今对红甜菜块根以及其中甜菜红素的抗氧化性能研究报道较少。本研究探讨红甜菜块根中活性成分和甜菜红素的含量与其抗氧化性能之间的关系，为今后深入研究红甜菜的体外抗氧化活性以及深度开发和利用红甜菜提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂

供试红甜菜块根：2020 年11 月购自京东商城，产地江苏。放入4 ℃冰箱备用。甜菜红素标准品购自孟成科技（上海）有限公司，TPTZ、DPPH、ABTS购自卡迈舒（上海）生物科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 红甜菜冻干粉的制备

取红甜菜根去皮，切成1 cm×0.5 cm 细丝，放入-20 ℃冰箱预冻24 h 后，用真空冷冻干燥机干燥48 h，转移至捣碎机捣碎，得到红甜菜冻干粉，共制备3批，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 甜菜红素含量的测定

1.3.1 红甜菜中红色素物质的鉴定

准确称取上述制备的红甜菜冻干粉1 g，用醋酸—醋酸钠缓冲液（pH 5.4）提取体内甜菜红色素，低速离心30 s，取上清液在400～700 nm的可见光区进行波长扫描，确定其最大吸收光谱。

1.3.2 甜菜红素标准曲线的绘制

称取甜菜红素标准品0.1 g，用pH 5.4 提取液配制浓度为1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL标准品溶液。在酶标仪535 nm处测定吸光度。以甜菜红素标准品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制甜菜红素标准曲线。

1.3.3 甜菜红素含量的测定

称取红甜菜冻干粉各0.1 g，用pH 5.4 提取液定容，冷冻离心，取上清300µL 于酶标仪在535 nm 处测定吸光度，重复3次取平均值，计算甜菜红素含量。

式中c1为甜菜红素提取物的浓度；m1为样品质量；V1为提取液体积50 mL；C为样品中甜菜红素含量。

1.4 抗氧化活性分析

1.4.1 FRAP法

以FeSO4标准品摩尔浓度（µmol/mL，x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制FeSO4标准曲线，表明FeSO4标准品摩尔浓度在0.4～3 mg/mL范围内线性关系良好。其线性回归方程为：

取100、500、1 000、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000µg/mL红甜菜水溶液样品，于60 ℃、250 W 条件下超声提取。取上清5 µL 加25 µL 蒸馏水与170 µL FRAP 工作液（0.3 mmol/mL CH3COONa 缓冲液∶10 mmol/mL TPTZ∶20 mmol/mL FeCl3按10∶1∶1混匀），混合液反应时间为10、20、30 min，置于酶标仪在590 nm 处测吸光值。样品最终的总抗氧化能力以FeSO4的当量浓度（FRAP值）表示，试验重复3次。

1.4.2 DPPH法

以Trolox 标准品（天然水溶性VE）质量浓度（µg/mL，x）为横坐标，517 nm 吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，表明Trolox标准品质量浓度在5～35 mg/mL范围内线性关系良好。其线性回归方程为：

将不同浓度的红甜菜水溶液样品（同1.4.1），冰浴匀浆后转入离心管中。12 000 r/min，4℃离心10 min，取上清150µL 加150µL DPPH 工作液（200 mmol/mL）混匀，以80%甲醇为对照，反应时间为10、30、45 min，置于酶标仪在517 nm处测定吸光值，试验重复3次。

式中A测定为样品+工作液，A对照为样品+80%甲醇，A空白为80%甲醇+工作液。

1.4.3 ABTS法

以Trolox 标准品质量浓度（µg/mL，x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，表明Trolox 标准品质量浓度在20～220 mg/mL范围内线性关系良好。其线性回归方程为：

将不同浓度红甜菜水溶液样品（同1.4.1），置于60 ℃超声提取30 min，12 000 r/min离心，取上清10µL与190 µL ABTS 工作液（7 mmol/mL ABTS∶2.45 mmol/mL K2S2O8溶液1∶1 混匀）混匀，以无水乙醇为对照，以Trolox 当量（TEAC）为标准，反应时间为10、15、20 min，在酶标仪734 nm 测吸光值，试验重复3 次。ABTS 自由基清除率计算同公式（2）。

式中A测定为样品+工作液，A对照为样品+无水乙醇，A空白为无水乙醇+工作液。

1.5 数据分析

所有试验重复测定3 次，采用IBM SPSS Statistics 25 软件对所测数据进行方差分析和Pearson 相关性分析。Excel绘图，结果以平均值±标准偏差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 甜菜红素含量

由图1 可见，甜菜红素提取液在可见光区535 nm 处有最大吸收峰，与甜菜红素标准品的吸收峰值一致。通过甜菜红素标准曲线分析表明，其线性回归方程为y=0.1072x+0.0005（R2=0.9994，y为吸光值，x为甜菜红素标准品质量浓度mg/mL）。这说明在甜菜红素质量浓度1～8 mg/mL 范围内线性关系良好（图2）。经检测，本试验红甜菜根中的甜菜红素含量为2.53%。

图1 甜菜红素提取液吸收光谱扫描Fig.1 Absorption spectrum scanning of betacyanin extract in red beet

图2 甜菜红素标准曲线Fig.2 Standard curve of betacyanin

2.2 红甜菜抗氧化能力分析

2.2.1 总抗氧化能力

如图3A 所示，0～30 min 内红甜菜水提物随着浓度100～10 000 μg/mL 的增加，FRAP 值随之增大。即FRAP法测定红甜菜提取物总抗氧化能力的精确反应时间为30 min，其抗氧化活性也随着水提物浓度增加而增强。

图3 红甜菜总抗氧化能力（A）、DPPH（B）和ABTS+（C）自由基清除能力分析Fig.3 Total antioxidant capacity（A）,DPPH（B）and ABTS+（C）radical scavenging activity analysis of red beet

2.2.2 DPPH自由基清除能力

在Trolox 标准品质量浓度5～35 mg/mL 范围内线性关系良好。红甜菜水提物浓度为4 mg/mL，反应30 min 时对DPPH 自由基清除能力达到峰值91.92%，红甜菜提取物清除DPPH 自由基能力的最佳反应时间为30 min，样品浓度在100～10 000µg/mL内，对DPPH 自由基的清除能力先增后减，在浓度为4 mg/mL 时清除能力最佳（图3B）。

2.2.3 ABTS+自由基清除能力

如图3C 所示，在Trolox 标准品质量浓度20～220 µg/mL 范围内线性关系良好。红甜菜水提物浓度为100～10 000 µg/mL，时间在0～20 min 内随着浓度的增加，对ABTS+自由基清除能力逐渐增强，最高达83.79%，即对ABTS+自由基最高清除能力最佳反应时间为20 min。

2.3 红甜菜抗氧化活性与甜菜红素间相关性分析

以FRAP、DPPH和ABTS三个指标检测红甜菜中甜菜红素含量与抗氧化活性的相关性。相关性分析（表1）表明，甜菜红素含量与抗氧化活性呈极显著正相关，相关系数为0.965～0.995。

表1 红甜菜抗氧化活性与甜菜红素含量相关性分析Table 1 Correlation analysis between antioxidant activity and betacyanin content in red beet

3 讨论

本研究测定的目的材料中，甜菜红素的含量为2.53%，相对含量较高。众多研究表明，红甜菜体内具有抗氧化功能的活性物质为：甜菜红素、花青素、甜菜多糖等，其中甜菜红素为主要功能活性成分[14]。甜菜红素的主要成分为5-O-β-葡糖苷，经诱导之后能产生泛醌还原酶，其中酚基和环胺基都能够作为电子供体，参与生物体的氧化还原反应和自由基的清除过程，甜菜红素的这两个功能基团是红甜菜具有抗氧化能力的重要原因[15-16]。甜菜红素由于具有较强的稳定性和抗氧化性能，故作为安全性能较好的生物活性添加剂，被广泛应用于食品生产领域。甜菜红素的另一种具有抗氧化性能的色素是花青素。花青素是黄酮类色素，其中羰基、双键和羟基不仅能够清除自由基，还能够捕获自由基，阻断自由基反应，起到减少生物体内自由基的作用。花青素对于自由基的清除能力也是红甜菜抗氧化性能的重要来源之一[17]。

通过对DPPH、ABTS、FRAP 等自由基的清除测定出红甜菜提取物的抗氧化能力强于水溶性VE。有研究用高纯度的红甜菜水溶提取物对·OH（羟自由基）和O2·-（超氧阴离子自由基）的清除能力和油脂过氧化的抑制能力，来衡量红甜菜提取物的抗氧化性能。结果显示，红甜菜提取物的各种抗氧化性能均强于VC[18]。使用H2O2体系作为抗氧化评价指标，低浓度的红甜菜提取物对H2O2有较好的清除能力，在一定范围内的清除能力强于抗坏血酸；并且随着浓度的增加，清除能力显著增加[19]。上述众多试验的研究结果与本研究一致：红甜菜提取物具有较强抗氧化性，在一定范围内，红甜菜的抗氧化能力随着提取物浓度的增大而升高，即甜菜抗氧化能力与提取物浓度具呈剂量—效应关系。

生物体内自由基的产生、积累与细胞衰老、癌症以及心血管疾病的发生密切相关，故自由基的清除和抗氧化功能产品的研发是当下研究的热点。本研究发现红甜菜提取物在体外具有较强的活性氧清除能力，因此作为天然的抗氧化剂，红甜菜在食用和药用方面，具有广阔的应用潜力。

4 结论

总的来说，红甜菜样品内的甜菜红素含量可以用于甜菜红素的提取。随着红甜菜水提物浓度的增加，可以反映总抗氧化能力的FRAP 值也随之增大；4 mg/mL的红甜菜水提物，在30 min 内清除DPPH 自由基效果高达91.92%；对ABTS+自由基的清除能力也随着红甜菜提取物浓度的增加而逐渐增强，最高达83.79%。因此，在一定范围内，甜菜红素含量与抗氧化活性呈极显著正相关。可以推断，红甜菜的抗氧化能力随着其活性成分含量的增加而升高，作为其主成分的甜菜红素在体外有较好的抗氧化效果。