白及不同极性提取部位对小鼠的止血作用及其机制

杨丽丽， 杨平飞， 韩 雪， 刘 筱， 黄苏豫，2， 刘佳微，2， 吴明开*

(1.贵州省现代中药材研究所/贵州省农业生物技术重点实验室， 贵州 贵阳 550006； 2.贵州大学， 贵州 贵阳 550025)

白及为兰科植物白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb.F.]的干燥块茎，是《中国药典》收载的常用中药之一，广泛用于治疗吐血、咳血、肺结核吐血、外伤出血、溃疡病出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等病症，疗效显著[1]。白及主要含有联苄类、联菲类、二氢菲类、苷类及白及多糖等多种化合物[2]。目前，对白及的研究主要涉及种植加工、成分提取分离与性质研究、抗氧化活性、药理活性以及药理作用和临床应用等[3]，对白及多糖的研究也较多，但缺乏有效的提取分离方法，致使其组分、结构和生物活性研究不深入。雌雄动物在生理学上的特异性常常导致对药物的反应也存在差异，到目前为止，对白及止血作用的活性部位、对雌雄动物的作用差异及其作用机制缺乏系统的比较。为此，笔者对白及进行提取并研究乙酸乙酯部位、乙醇部位、水提部位对雌雄小鼠的止血作用，在此基础上探讨其发挥止血作用的机制，为白及的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物 SPF级昆明小鼠，体质量20～22 g，均购自长沙天勤生物科技有限公司，许可证号:scxk(湘)2014-0010。小鼠自由摄食、饮水，试验前适应性饲养7 d。

1.1.2 药物 白及为安龙县欣蔓生物科技有限责任公司白及基地采收的干燥块茎，原植物经贵阳中医学院何顺志教授鉴定为兰科植物白及[Bletillastriata(Thund.) Reichb.F.]。

1.1.3 试剂 云南白药，云南白药集团股份有限公司，批号:ZMA141520141210；羧甲基纤维素钠，生工生物工程(上海)有限公司，批号:F531BA0017；肝素钠注射液，江苏万邦生化医药股份有限公司，批号:5789001；水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号:20190012；凝血酶-抗凝血酶复合物，批号:20190818，购自贵州绿盟英创生物科技有限公司；纤溶酶原激活物抑制剂-1，批号:20191124，购自贵州绿盟英创生物科技有限公司；乙醇为分析纯。

1.1.4 仪器 Centrifuge 5418R台式离心机，德国eppendorf；DK-98-ⅡA恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；SAF-680T酶标仪，美国宝生物科技有限公司；Hei-VAP Value旋蒸仪，德国海道尔夫Heidolph有限公司；Milli-Q Reference超纯水机，美国Millipore有限公司；METTLER AE240十万分之一电子天平，梅特勒-脱利多仪器上海有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海博讯有限公司医疗设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 准确称取白及干燥块茎粉碎1 000 g，75%乙醇回流提取6次，回流2 h/次，提取液减压浓缩至无醇味，水浴上蒸干，得白及醇提浸膏。取适量醇提浸膏用蒸馏水混悬后乙酸乙酯萃取至色淡。萃取液及萃取后的水层部分减压浓缩至固体，真空干燥获得乙酸乙酯提取物、乙醇提取物及水层部分，置于干燥器中避光保存待测[4]。

1.2.2 阳性对照药干预 SPF级昆明小鼠按云南白药人临床用量(2 g/人)的20倍灌胃给药，即0.667 g/kg。称取云南白药粉末6.67 g，加入0.5%羧甲基纤维素钠100 mL研磨均匀即得给药剂量。

1.2.3 白及提取物干预 SPF级昆明小鼠按白及人临床用量(15 g/人)的20倍剂量灌胃给药，即为5 g/kg。称取白及醇提浸膏50 g加入0.5%羧甲基纤维素钠100 mL研磨均匀，灌胃量6.8 g/kg。

1.2.4 全身肝素化小鼠

1)出血时间(BT)测定。取昆明小鼠60只(雌雄各半)，随机平分为6组，即空白对照组、肝素化模型组、云南白药组、白及乙醇提取物组、白及乙酸乙酯提取物组、白及水提取物组。空白组和肝素化模型组分别给予0.5%羧甲基纤维素钠生理盐水20 mL/kg，其余组小鼠分别灌胃相应药物和提取物组，给药1次/d，连续5 d，第5天灌胃给药60 min后，除空白组外，其余各组均尾静脉注射肝素钠3.2 U/只，15 min后用手术刀于距小鼠尾尖0.5 cm处割断，待血液自行溢出时开始计时，每隔30 s用滤纸吸附血滴1次，直至滤纸吸附无血迹。人工形成创面到出血停止所经时间为小鼠出血时间(BT)。

2)小鼠凝血时间(CT)测定。利用出血时间测定组的昆明小鼠，第5天给药60 min后，除空白组外，其余各组均尾静脉注射肝素钠3.2 U/只，15 min后用内径1 mm、长10 cm的毛细玻璃管从小鼠内眼球后静脉丛取血，待血液充满玻璃管时开始计时，每隔30 s折断两端毛细玻璃管(约0.5 cm)，并缓慢向左右拉开，观察折断处有无血凝丝出现。血液充满玻璃管开始至出现血凝丝所经时间为小鼠凝血时间(CT)。

3)血小板聚集率测定。按照测定出血时间的方法，连续灌胃给药6 d，第7天灌胃给药60 min后，腹腔注射水合氯醛100 g/L麻醉，用3.8%枸橼酸钠抗凝真空采血管腹主动脉釆集血样，800 r/min离心10 min，分离上层血浆即得富血小板血浆(PRP)，余下部分3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆即得贫血小板血浆(PPP)，用PPP调PRP中血小板的计数为3×1011个/L，用PPP调零后，取PRP 290 μL，37℃孵育60 s后，加入终浓度为 5 μmol ADP 10 μL，记录5 min内血小板的最大聚集率。

4)凝血因子测定。昆明小鼠分组及给药方法同血小板聚集率测定。取枸橼酸抗凝全血，3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆备用。按试剂盒要求测定凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，结果用Mean±SEM表示。经单因素方差分析(One-Way ANOVA)后，采用Turkey’s test分析方法比较组间差异，两组间比较采用t-test法。

2 结果与分析

2.1 白及不同极性提取部位干预雌雄小鼠的出血时间

小鼠尾静脉注射肝素钠注射液后，出血时间与空白组相比显著延长(P<0.005)，说明小鼠出血模型建模成功。与模型组相比，雄性、雌性小鼠云南白药干预组均能显著缩短全身肝素化小鼠的出血时间(P<0.005)，白及乙醇提取物、水提取物干预后的雌雄小鼠均显著表现出与模型组更少的出血时间(P<0.005，P<0.01)；乙酸乙酯提取物干预雌鼠的出血时间与模型组无显著差异(P>0.05)，干预雄鼠的出血时间显著高于模型组(P<0.05)(图1A、图1C)。将雌雄小鼠的检测结果组合进行统计分析，云南白药、白及乙醇提取物、水提取物干预均能明显缩短全身肝素化小鼠的出血时间(P<0.005)，乙酸乙酯提取物干预的出血时间无显著变化(P>0.05)(图1B)；云南白药、白及乙醇提取物、白及水提取物干预对全身肝素化雌雄小鼠出血时间的缩短率分别为74.36%、48.96%和31.24%(图1D)。

注：Con为对照组，Mod为模型组，YNBY为云南白药干预组，H2O为白及水提取部位干预组，EtOAc为白及乙酸乙酯提取部位干预组，EtOH为白及乙醇提取部位干预组。***表示与对照组比P<0.005；#表示与模型组比P<0.05，##表示P<0.01，###表示P< 0.005。下同。图1 不同组雌雄小鼠的出血时间(n=10)

2.2 白及不同极性提取部位干预雌雄小鼠的凝血时间

小鼠尾静脉注射肝素钠注射液后，凝血时间与空白组相比显著延长(P<0.005)，与模型组相比，雄性、雌性小鼠云南白药、白及乙醇提取物、白及水提取物干预均能显著缩短凝血时间(P<0.005，P<0.01)，乙酸乙酯提取物干预雌鼠的凝血时间与模型组无显著差异(P>0.05)，乙酸乙酯提取物干预雄鼠的凝血时间显著高于模型组(P<0.05)(图2A、图2C)。将雌雄小鼠的检测结果组合并进行统计分析，云南白药、白及乙醇提取物、水提取物干预均能显著缩短小鼠的凝血时间(P<0.005)，乙酸乙酯提取物干预的出血时间无显著影响(P>0.05)(图2B)；云南白药、白及乙醇提取物、白及水提取物干预雌雄小鼠凝血时间的缩短率分别为82.16%、76.44%和34.26%(图2D)。

图2 不同组雌雄小鼠的凝血时间(n=10)

2.3 白及不同极性提取部位干预雌雄小鼠血小板的凝集率

云南白药、白及水提取部分、白及乙醇提取部分干预均能显著提高雄性小鼠的血小板凝集率(P<0.05，P<0.01，P<0.005)，乙酸乙酯提取物的血小板凝集率无显著变化(P>0.05)(图3A)。将雌雄小鼠的检测结果组合并进行统计分析，云南白药、白及水提取物、乙醇提取物干预分别提高小鼠血小板的凝集率25.22%、16.36%和11.32%(图3B)。

注：*表示与对照组比P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005。下同。图3 不同组雌雄小鼠血小板的凝集率(n=10)

2.4 白及不同极性提取部位干预雌雄小鼠凝血因子的含量

云南白药、白及水提取物干预均能显著提高雌雄小鼠血浆中TAT和PAI-1含量(P<0.01，P<0.05)，乙醇提取物对雌雄小鼠血浆中TAT和PAI-1含量无显著影响(P>0.05)；乙酸乙酯提取物干预减少小鼠血浆中TAT含量，对PAI-1含量无显著作用(图4A、图4C)。将雌雄小鼠的检测结果组合并进行统计分析，云南白药、白及水提取物干预分别提高小鼠血浆中TAT含量20.36%和11.32%，PAI-1含量分别提高18.89%和9.12%(图4B、图4D)。

图4 不同组雌雄小鼠血浆中TAT和PAI-1的含量(n=10)

3 结论与讨论

白及的组成成分复杂，许多功能成分还没有被发现、分离和利用。随着一些新的活性物质被不断发现和分离，其生物活性、药理活性及其作用机制需要阐明。董莉等[5]研究表明，白及块茎水提物或极性溶剂醇提取物对大鼠实质性器官如肝、脾、肌肉血管出血的止血和凝血效果良好。白及水提物中多为大极性分子，其中包括大量的多糖成分[6]。有研究表明，白及胶多糖发挥止血功能可能是激活了大鼠内源性和外源性凝血系统，促进血小板聚集而达到止血作用[7-10]。白及止血作用的主要有效成分是水溶性部分和醇溶性部分，能显著提高血小板最大凝集率，促进血小板凝集。白及非多糖组分BS-80EE具有促进ADP诱导大鼠体内血小板的聚集作用，缩短全身肝素化小鼠的出血时间和凝血时间，作用效果呈剂量关系[6]。原因可能是白及能使血细胞凝集，血小板活化、形变，聚集，还能缩短凝血酶生成时间而发挥止血作用。

研究结果表明，白及醇提物、水提物对雌雄小鼠均具有止血作用，其中白及水提物止血作用最显著，乙酸乙酯提取物对雄性小鼠具有延长凝血、出血时间的作用，但对雌性昆明小鼠未造成明显影响，可能是激素与凝血调节相关酶能够相互作用，导致药物在雌雄昆明小鼠中的止血作用效果存在差异；白及水提物能够显著促进血小板凝集作用，并明显增加纤溶酶原激活物抑制剂-1含量。白及3种提取物的止血作用，以白及水提取物的止血效果最优，表明其具有良好的止血功效，可通过促进血小板聚集和凝血而发挥止血作用。