2型糖尿病气阴两虚患者血清胆汁酸代谢物的多元分析研究

陈冰婷，杨 建，白 钰，伊丽则热·艾拜杜拉，谭惠文，马晓丽

（新疆医科大学1药学院，乌鲁木齐 830011；2第四附属医院内分泌科，乌鲁木齐 830011）

2型糖尿病(T2DM)是一种以血糖持续升高为临床表现的代谢性疾病，其发病呈现年轻化趋势,已经成为全球重大健康问题之一[1-2]。中医将2型糖尿病列为“消渴病”范畴,对糖尿病的辨证分型主要包括阴虚热盛型、气阴两虚型、阴阳两虚型、血瘀气滞型,其中气阴两虚型最为常见[3-5]。中医对糖尿病的辨证分型较为主观，采用现代医学的技术手段帮助中医病症分型是有必要的[6]。胆汁酸（BA）可通过影响肠道激素的分泌参与调节葡萄糖代谢和胰岛素分泌[7]，其代谢谱的变化是糖尿病等代谢性疾病发生发展的灵敏指标。进一步完善胆汁酸代谢谱的研究，对糖尿病的诊断及中医证型研究具有重要的指导意义。本研究采用超高效液相色谱-质谱联用技术分析研究糖尿病气阴两虚患者和正常气阴两虚者血清中胆汁酸的含量差异，为气阴两虚型糖尿病的临床诊断和治疗提供一种新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2015年1月-2018年12月新疆医科大学第四附属医院内分泌科收治的30例2型糖尿病气阴两虚患者为糖尿病气阴两虚组，其中男16例，女14例，年龄40～65岁，平均年龄（49.87±10.03）岁;选择同时期25例气阴两虚证患者为正常气阴两虚组，其中 男10例，女15例，年龄35～60岁，平 均 年龄（48.13±9.49）岁。患者均签署知情同意书，本研究经新疆医科大学第四附属医院伦理委员会通过（20140304-133）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准参照2019年世界卫生组织（WHO）[8]中的诊断标准：（1）有糖尿病症状（典型症状：多饮、多食、多尿、体质量下降），随机血糖≥11.1mol/L；（2）空腹血糖≥7.0mmol/L；（3）进行葡萄糖耐量试验（OGTT）后，餐后2 h血糖≥11.1mmol/L。凡符合上述标准中的任一条者可诊断为糖尿病。

1.2.2 中医辨证标准参照《中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原则》[9]中的气阴两虚证标准,进行中医辨证分型,气阴两虚型:倦怠乏力,自汗盗汗,气短懒言,口渴喜饮,五心烦热,心悸失眠,渡赤便秘,舌红少津,舌体胖大,苔薄或花剥,脉弦细或细数。

1.3 纳入与排除标准

1.3.1 纳入标准参照“1.2诊断标准”明确诊断为2型糖尿病气阴两虚患者。

1.3.2 排除标准I型糖尿病患者或其他疾病引起的血糖升高；严重糖尿病并发症者；有严重的心、肝、肾等并发症或合并其他严重原发性疾病者；妊娠期或哺乳期患者；精神病患者；不愿意配合者。

1.4 血清中胆汁酸含量的测定采集两组患者早餐前空腹静脉血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，保存于-80℃冰箱中待测。采用超高液相串联质谱（UPLC-MS/MS）技术的代谢组学方法[10]，建立血清中29种胆汁酸的定量检测方法，在进行系统的方法学考察后，测定血清中胆汁酸的含量。

1.5 统计学处理采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计学分析，计量资料若符合正态分布，采用均数±标准差（±s）表示；不符合正态分布采用中位数（四分位数），以P＜0.05为差异有统计学意义。采用SIMCA软件(V15.0.2)对数据进行对数转换加UV格式化处理，对第一主成分进行OPLS-DA建模分析，用交叉验证后得到的R2Y（模型对分类变量Y的可解释性）和Q（2模型的可预测性）对模型有效性进行评判，通过置换检验对模型有效性做进一步的检验。根据变量投影重要度（VIP）＞0及P＜1筛选差异代谢物，对差异代谢物的定量值计算欧式距离矩阵，以完全连锁方法对差异代谢物进行聚类，并以层次聚类图进行展示，采用ROC分析以寻找潜在的生物标志物，ROC曲线下的面积（AUC）值越接近1，临床诊断效能越大，可认为该差异代谢物是潜在的生物标志物。

2 结果

2.1 两组一般资料的比较两组间患者性别、年龄、体质指数差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常气阴两虚组比较，2型糖尿病气阴两虚组患者空腹血糖升高，差异有统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 2型糖尿病气阴两虚患者和正常气阴两虚患者一般资料比较

2.2 血清胆汁酸含量的比较与正常气阴两虚组比较，2型糖尿病气阴两虚组患者血清中甘氨氨熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、胆酸含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 2型糖尿病气阴两虚患者和正常气阴两虚患者的胆汁酸含量的比较/（nmol/L）

2.3 血清胆汁酸的多元统计分析糖尿病气阴两虚组和正常气阴两虚组的样本区分显著,两组的R2=0.018 7,Q2=-0.278，Q2的回归线与纵轴的截距小于零，表明该模型具有良好的稳健性，适合于后续分析的优化,见图1、2。

图1 OPLS-DA模型得分散点图

图2 OPLS-DA模型的置换检验结果图

2.4 血清胆汁酸差异代谢物的筛选与正常气阴两虚组（NH）相比，2型糖尿病气阴两虚组（DH）的胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、异石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸的含量下降，其中胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸变异重要性（VIP）＞1，在两组间起着重要的作用，见表3。

表3 2型糖尿病气阴两虚组和正常气阴两虚组的胆汁酸差异代谢物的筛选表

2.5 血清胆汁酸表达量的层次聚类分析图与正常气阴两虚组相比，2型糖尿病气阴两虚组中的胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、异石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸呈现低表达的趋势，而石胆酸、脱氧胆酸、12-酮基石胆酸、甘氨胆酸、鹅脱氧胆酸呈现高表达的趋势，见图3。

图3 血清胆汁酸的层次聚类分析图

2.6 血清胆汁酸生物标志物预测能力评估甘氨熊脱氧胆酸（AUC=0.71）、牛磺鹅脱氧胆酸（AUC=0.66）、胆酸（AUC=0.67），临床诊断效能较大,被认为是糖尿病气阴两虚型患者的潜在生物标志物，能为气阴两虚型糖尿病进一步研究提供更多信息，见图4。

图4 血清胆汁酸的ROC曲线分析

3 讨论

中医将糖尿病称为“消渴”，临床症状表现为多饮、多食、多尿、消瘦及疲乏等特征[11]。2型糖尿病(消渴病)中,气阴两虚证是本研究中占比最大的证型且最为常见，气阴两虚证患者发病年龄小且病程较其他证型长。在连续血糖监测系统中，气阴两虚证型的血糖较其他证型难监测[12]，因此建立一个灵敏的诊断方法对及时干预对糖尿病及并发症的发生发展和治疗起着重要作用。

血清胆汁酸(BA)是脂质吸收和胆固醇代谢的重要调控因子，越来越被认为参与调节与代谢疾病相关途径，包括脂质和葡萄糖代谢、能量消耗和炎症等[13-15]。本研究发现12种胆汁酸包括甘氨熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、12-酮基石胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、异石胆酸、石胆酸承载了气阴两虚糖尿病组与正常组的重要信息。

Shimak等[16]的研究证明牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)在啮齿动物模型和T2DM患者中具有抗炎和改善胰岛素敏感性的作用，Liu等人[17]的研究表明胆酸在调节BA动态平衡方面有着重要的作用。本研究结果显示，甘氨熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、胆酸的含量在2型糖尿病气阴两虚组显著降低，且在ROC分析中甘氨熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、胆酸临床诊断的效能较大,被认为是2型糖尿病气阴两虚型患者的潜在生物标志物。有研究表明[18]，通过外源性补充甘氨熊脱氧胆酸能够拮抗FXR受体进而起到降低血糖的作用。胆酸是人类主要的胆汁酸，胆酸的缺乏可能会引起多种疾病，可作为受胆汁酸合成障碍影响的患者的治疗药物[19]。有研究[20]认为牛磺酸结合的胆汁酸在T2DM患者中含量较高，然而在我们的研究中TCDCA表现出下调趋势。

综上所述，甘氨熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、胆酸在2型糖尿病气阴两虚患者中的含量降低，能为2型糖尿病气阴两虚型的现代化诊断和治疗提供新的思路。