SXZG药物对去卵巢大鼠髁突OPG及OPGL表达的影响

从丛，魏霞臻

（1.长安大学医院，陕西西安 710064；2.西安交通大学陕西天奎生物医药科技有限公司，陕西西安 710061）

颞下颌关节紊乱综合征是一类病因尚未完全清楚而又有相同或相似临床症状的一组疾病的总称，可伴有颞下颌关节区疼痛、下颌运动异常、关节弹响及功能性障碍等症状[1]。研究证实，颞下颌关节髁突软骨是雌激素作用的靶组织，雌激素在颞下颌关节的生长发育及颞下颌关节紊乱的发生、发展中具有重要作用，雌激素缺乏导致的骨质疏松症可以造成颞下颌关节骨退行性病变[2-4]。

本研究中的试验药品SXZG药物是以沙棘油脂肪酸为主成分的中药组方制备成的中药软胶囊剂，其主要成分含十六碳酸、十六碳烯酸、十八碳一烯酸、十八碳二烯酸、十八烷酸等饱和/不饱和脂肪酸。前期研究证实SXZG药物可以降低绝经后骨质疏松症的发病概率，但是其对颞下颌关节髁突有何影响目前还没有研究。本实验通过建立SD大鼠骨质疏松模型，制作大鼠颞下颌关节髁突部免疫组化染色切片来观察SXZG药物对髁突中骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）及骨保护素配体（Osteoprotegerin Ligand，OPGL）表达的影响，初步研究SXZG药物对去卵巢骨质疏松大鼠颞下颌关节的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康SD雌性大鼠70只，其中8月龄60只，3月龄10只，购自北京医科院实验动物研究所[合格证号：SCXK（京）2009-0004]，质量 290±20 g。

1.2 材料与试剂

SXZG，批号20110312，西安交通大学天奎生物医药科技有限公司；己烯雌酚，批号20100920，合肥久连制药有限公司；仙灵骨葆胶囊，批号110784，贵州同济堂制药有限公司；OPG多克隆抗体及OPGL多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色试剂盒，上海科兴生物科技有限公司；2%戊巴比妥钠，江苏恩华药业股份有限公司；4%甲醛，天津市大茂化学制剂厂；EDTA，0.5 mol/L，广州化学试剂厂；二甲苯，天津市大茂化学制剂厂；PBS，0.01 mol/L，上海化学试剂三厂；枸橼酸钠缓冲液，0.01 mol/L，天津市大茂化学制剂厂；3%过氧化氢，广州化学试剂厂；山羊血清，北京中杉金桥有限公司；苏木素，北京化学试剂公司。

1.3 仪器与设备

HHWCu600型恒温水浴箱，上海医疗器械厂；S-WSH型超纯水仪，美国Millipore；SP2型激光扫描共聚焦显微镜，德国Leica；QDR—4500A型骨密度测定仪，美国HOLOGIC。

1.4 实验方法

1.4.1 建模实验

在60只8月龄SD大鼠中随机选取50只，将2%戊巴比妥钠以40 mg/kg的剂量注射入大鼠腹腔进行全麻，置于俯卧位固定，在背部1/3处剪毛备皮，沿背部正中线向下作一个纵形切口，切开皮肤及皮下组织，沿肩胛分别于左右两胁下剪开腰肌，暴露出卵巢及子宫角，将双侧卵巢完整摘除，术后分层缝合肌肉及皮肤。剩余10只8月龄SD大鼠作为假手术组，全麻后打开腹腔，暴露子宫与卵巢，但并未将其切除，直接缝合。手术3个月后，在50只去势大鼠中随机抽取10只，与假手术组的10只大鼠比较，用骨密度测定仪检测大鼠腰椎、胫骨、股骨的骨密度，检测结果显示去势大鼠腰椎、胫骨、股骨三个部位的骨密度均较假手术组下降（P＜0.05），说明骨质疏松模型建模成功。

1.4.2 分组及给药

建模成功后，将50只去势大鼠随机分为5组，每组10只，灌服不同的药物，即SXZG剂量1组、SXZG剂量2组、己烯雌酚片组（阳性对照）、仙灵骨葆胶囊组（阳性对照）和空白乳剂组；另外2组为假手术组和青年对照组（3月龄大鼠），喂服空白乳剂。大鼠连续灌药3个月后，按组别处死，解剖分离出下颌骨。

1.4.3 制作免疫组化染色切片

将大鼠下颌骨置于4%甲醛中固定一周，固定后将下颌骨放入EDTA脱钙液中充分脱钙8周，包埋，将髁突区域石蜡包块用切片机制作4～5 μm厚的切片，68 ℃烤片20 min后二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS冲洗5 min×3次；枸橼酸钠缓冲液中微波炉内加热进行抗原修复，PBS冲洗5 min×3次；3%过氧化氢37 ℃孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶活性；吸水纸吸去切片上多余的水分，滴加正常山羊血清进行封闭，室温孵育10 min。倾去切片上的血清，滴加一抗（兔抗鼠）工作液，4 ℃过夜；室温下复温30 min，PBS缓冲液冲洗3 min×3次；滴加二抗（羊抗兔）工作液，37 ℃孵育20 min，PBS缓冲液冲洗3 min×3次；DAB显示剂显色，显微镜下控制反应时间，之后自来水充分冲洗，苏木素进行复染，梯度酒精脱水后，二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察。

1.4.4 观察指标及评价标准

采用激光扫描共聚焦显微镜给所有免疫组化切片照相，每个切片取3个视野。OPG和OPGL免疫组化结果以胞浆呈棕黄色染色为阳性表达，利用MOTIC Med 6.0数码图像分析系统测定每个视野的免疫组化染色灰度值，计算出平均灰度值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计分析软件对各组数据进行分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 下颌骨髁突免疫组化染色观察

显微镜下可见OPG及OPGL在大鼠髁突软骨的全层均可表达，在软骨下骨组织中的成骨细胞、破骨细胞、骨髓基质细胞及骨小梁边缘的骨细胞中有不同程度表达，结果见图1。

图1 各组大鼠髁突中OPG和OPGL的表达

2.2 各组大鼠颞下颌关节髁突中OPG及OPGL表达灰度值比较

计算髁突中OPG及OPGL免疫组化染色灰度值，其数值越大，表示细胞因子表达的量越小。与假手术组相比，去势组大鼠髁突中OPG表达明显减少（P＜0.05），而OPGL的表达明显增多（P＜0.05）；SXZG剂量1组、SXZG剂量2组大鼠髁突中OPG的表达均较去势组增多（P＜0.05），OPGL阳性表达均较去势组减少；SXZG剂量1组、SXZG剂量2组与假手术组相比，髁突中OPG的阳性表达无显著性差异（P＞0.05），OPGL表达无显著性差异（P＞0.05）；己烯雌酚片组及仙灵骨葆胶囊组大鼠髁突中OPG表达均较去势组增加（P＜0.05），OPGL的表达较去势组降低（P＜0.05），结果见表1。

表1 各组大鼠髁突OPG及OPGL表达灰度值比较

在口腔临床中，颞下颌关节紊乱综合征是一种较为常见的疾病，表现为关节结构紊乱、骨关节病、关节炎及周围软组织损伤。研究发现，骨关节炎的发生与绝经期女性体内雌激素水平下降有关，雌激素的缺乏可导致绝经期妇女骨关节炎的发生[5]。颞下颌关节骨关节病属于颞下颌关节紊乱综合征（Temporomandibular Disorders，TMD）分类中的常见类型，是一种非感染性、非炎症性的退行性关节病变[6]。雌激素对成骨细胞和破骨细胞有一定调节作用，绝经后妇女由于雌激素水平降低导致骨形成速率降低，使骨吸收高于骨形成，最终导致骨质疏松[7]。然而，在骨质疏松的进展过程中，如何防止髁突软骨及软骨下骨组织随之发生改变，目前国内相关研究较少[8]。

OPG-OPGL-RANK（核因子-κB受体活化因子，Receptor Activator of NF-κB）系统是联系软骨与软骨下骨的一条重要路径，OPG与OPGL的比例对软骨下骨组织的重建起到决定性作用[9]。研究发现，软骨细胞可分泌OPG与OPGL，关节软骨及软骨下骨组织中均有OPG与OPGL的表达，与骨关节炎的形成及关节旁骨丢失密切相关[10]。目前认为OPG是抑制破骨细胞最有效的细胞因子，其对破骨细胞的作用主要表现在可抑制破骨细胞的分化，抑制成熟破骨细胞的活性，并诱导破骨细胞凋亡，使得真正具有溶骨功能的破骨细胞数量减少，从而达到保护骨组织的作用。实验显示，OPG可以增加骨密度及骨小梁数目，控制钙的吸收，还可以通过抑制破骨细胞F-肌动蛋白环的形成来抑制骨吸收[11]。有学者认为，OPGL是唯一能直接刺激破骨细胞发育并使破骨细胞激活且可以抑制破骨细胞凋亡的细胞因子[12]。骨组织中OPGL的受体为RANK，主要表达在破骨细胞及破骨细胞前体细胞上，OPGL可通过与RANK的结合来激活NF-κB和c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal Protein Kinase，JNK），从而促进破骨细胞的分化，增加成熟破骨细胞的活性，阻止破骨细胞的凋亡，但OPGL的上述作用可被OPG竞争性地抑制，因为OPG能竞争性地结合OPGL或阻断OPGL与RANK的结合[13-14]。

本实验发现，与假手术组相比，去势组大鼠在切除卵巢后，下颌骨髁突中OPG表达明显减少，而OPGL表达明显增多，说明大鼠摘除卵巢后，髁突骨吸收活动增强，而骨形成减弱；在经SXZG治疗后，大鼠下颌骨髁突中OPG阳性表达较去势组增多，而OPGL阳性表达较去势组减少，说明SXZG可以增加去卵巢骨质疏松大鼠髁突的成骨作用，并抑制去卵巢骨质疏松大鼠髁突骨组织的骨吸收活动。

3 结论

通过摘除大鼠卵巢建立绝经后骨质疏松模型，将造模成功的雌性SD大鼠采用不同药物灌胃治疗后发现，SXZG可通过调节髁突中成骨细胞因子OPG及破骨细胞因子OPGL表达的比例来影响颞下颌关节髁突的骨代谢，从而改善去卵巢大鼠因雌激素水平下降导致的髁突部骨组织丢失。