胆碱能过活化状态下“疏肝调神”针法对CUMS抑郁大鼠行为学的影响

高静 赖名殷 梅氏清心 傅文 王孟雨 宁百乐,4 符文彬,4,5,6

(1河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2广州中医药大学第二临床医学院；3海南医学院中医学院；4广东省中医院大针灸科；5深圳宝安区针灸临床研究中心；6深圳市政府“医疗卫生三名工程”广东省中医院符文彬教授针灸学团队)

抑郁障碍是一种以快感缺失、持续而持久的心境低落为主要特征的常见的高患病率、高复发率的精神心理疾病〔1〕，影响着全球约17%的人口〔2〕。药物是目前抗抑郁治疗的主要手段，但起效慢、副作用大，且服用一线抗抑郁药的患者中仅约30%可解除症状等缺点〔3〕，大大降低了患者的依从性，增加了自杀和死亡的风险。针灸作为一种传统中医疗法早已应用于抑郁障碍的临床治疗实践中，以“百会、印堂、合谷、太冲”为主穴的“疏肝调神”法可有效改善抑郁症状，还能缓解抑郁相关失眠、胃肠功能紊乱、慢性疼痛等症状〔4,5〕，但是其作用机制尚未完全阐明。近年来研究证实，中枢胆碱能系统参与情绪调节过程〔6,7〕，其中乙酰胆碱(ACh)作为中枢神经系统的一种重要的神经递质，参与了抑郁障碍的发生发展过程〔8〕。胆碱能系统过度活化被认为是抑郁障碍发病的关键环节〔6〕，而抑制过度活化的胆碱能系统可能是抗抑郁的重要靶点〔9～11〕。本研究以胆碱能为切入点，观察在胆碱能过活化状态下，“疏肝调神”针法电针对慢性不可预知温和应激(CUMS)抑郁模型大鼠前额叶和血清胆碱能相关因子胆碱酯酶(AChE)，乙酰转移酶(ChAT)，乙酰胆碱(ACh)及去甲肾上腺素(NE)和皮质醇(CORT)水平和行为学的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康SPF级雄性成年SD大鼠60只，体重180～220 g。动物由广东省医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：〔SYXK(粤)2018-0092〕。动物饲养于广州中医药大学第一附属医院实验中心SPF级动物实验室，室温20～25℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h昼夜明暗交替。本实验通过广州中医药大学第一附属医院实验中心动物伦理委员会的批准(No.TCMF1-2018027)。

1.2仪器与试剂 木制旷场箱(80 cm×80 cm×40 cm，自制)；亚克力透明水桶(直径30 cm、高60 cm，自制)；AE-200型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；3K-30 低温高速离心机(美国Sigma 公司)；Thermo Multiskan FC酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；华佗牌一次性不锈钢针灸针(0.16 mm ×7 mm，苏州华佗医疗器械有限公司)；Hans-LH202H电针仪(南京济生医学科技有限公司)；蔗糖分析纯(广州化学试剂厂)；东莨菪碱(CAS：51-34-3，北京百灵威科技有限公司，批号：177490)；毒扁豆碱(CAS：64-47-1，英国TOCRIS Bioscience公司，批号：10A/222637)；大鼠Ach ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，货号：ml003048)；AChE酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国USBiological 公司，货号：023077)；ChAT ELISA试剂盒(美国USBiological 公司，货号：382349);NE ELISA试剂盒(台湾ABnova生物科技公司，KA3836)；CORT ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，货号：ml002874)。

1.3实验分组 将SD雄性大鼠按照体重因素分层随机法进行分组，分别为正常组、模型组，其中正常组不予任何处理，模型组采用CUMS建立抑郁大鼠模型，21 d后根据糖水偏好实验筛选出造模成功的大鼠，并根据糖水偏好率分层随机分为模型组、电针组、东莨菪碱组(阳性对照)、毒扁豆碱组(胆碱酯酶抑制剂)、电针+毒扁豆碱组，共6组，每组10只。

1.4CUMS造模方法 采用CUMS方法构建抑郁动物模型。根据既往研究及前期实验基础，总结出10种不同的刺激方法：禁食24 h、禁水24 h、潮湿垫料24 h、昼夜颠倒、冰水游泳(4℃，5 min)、行为限制4 h、45°倾笼24 h、夹尾2 min、85 dB噪音3 h、整夜LED频闪。刺激遵循随机原则，每日2种，连续2 d内不出现相同应激，持续42 d。

1.5电针干预及给药方法 于CUMS造模第22天开始电针或药物干预，持续3 w。针刺取穴采用符文彬〔4〕的“疏肝调神”法，包括百会、印堂、合谷、太冲。参考中国针灸学会实验针灸分会制定的《实验针灸穴位图谱》及《实验针灸学》大鼠穴位图谱进行定位取穴〔12〕。针刺时，动物保持清醒状态，以15°平刺百会、印堂，45°斜刺合谷、太冲，后将动物放置在悬挂式大鼠电针固定装置(国家实用新型专利，专利号：ZL 2019 2 1340810.6)固定，并将电针仪正负极分别接在合谷和太冲针柄上，调节参数为2/100 Hz,1～1.2 mA，以动物肢体微微颤动为度，百会、印堂针刺后留针不予加电，每日20 min。东莨菪碱组大鼠腹腔注射东莨菪碱(25 μg/kg)，每16 h 1次〔10〕；毒扁豆碱组大鼠腹腔注射毒扁豆碱(0.5 mg/kg)〔13〕，每日1次。电针+毒扁豆碱组大鼠先药物干预后再进行电针治疗，干预方法同电针组和毒扁豆碱组。每组大鼠针刺或药物干预时间固定在每日上午8∶00～12∶00进行。

1.6体重及行为学方法

1.6.1体重 于CUMS造模的第0天、21天、42天进行称重。

1.6.2糖水偏好实验 于CUMS造模的第21天、42天进行糖水偏好实验。为避免新奇恐惧先进行适应性训练，第1个24 h每笼放置两瓶1%蔗糖溶液，第2个24 h，每笼放置一瓶装普通饮用水，另一瓶装1%蔗糖溶液。24 h饮水剥夺后进行正式实验：每笼放置两个外观、容量相同且密封良好的水瓶，位置随机，分别装有普通饮用水和1%蔗糖溶液，每笼1只大鼠。记录1 h内每个瓶子液体消耗量(液体消耗量=起始重量-剩余重量)。计算各大鼠的糖水偏好率(%)=〔1% 蔗糖水消耗量/(1% 蔗糖溶液消耗量+普通饮用水消耗量)〕×100%。糖水偏好率的降低代表了大鼠的抑郁的核心症状快感缺失。

1.6.3强迫游泳实验 于CUMS造模的第42天进行强迫游泳实验。实验前，将大鼠于亚力克透明水桶内适应性游泳15 min(水深30 cm，水温25±1℃)。24 h后，进行正式实验。将大鼠放进相同的水桶内游泳6 min，并记录后4 min内的累计不动时间，即大鼠漂浮在水面不动或四肢轻微划动状态的累计时间，代表了大鼠的行为绝望状态。

1.6.4新环境抑制进食实验 于CUMS造模的第42天进行新环境抑制进食实验。实验前对大鼠进行24 h食物剥夺。实验时，预先在旷场箱中央放置一小块食物，将大鼠从旷场箱的一角放入，记录大鼠从进入旷场时到其抱起食物并进食的持续时间，即延迟进食时间，若期间未进食的则计为6 min。延迟进食时间代表了大鼠的活动能力及对新环境的兴趣力。

1.7取材 行为学测试结束后，各组取6只大鼠，将大鼠用100 g/ml水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，打开大鼠的胸腹腔，腹主动脉取穴后，以0.9%的氯化钠溶液心脏灌注(以肺、肝脏、眼睛等组织变白为止)，迅速开颅取脑，分离出前额叶，称重后放入相应编号的冻存管，于-80℃冰箱备用。

1.8ELISA检测前额叶中AChE、ChAT、ACh、NE和血清中CORT的含量 取血清和前额叶组织，严格按照试剂盒操作步骤，检测AChE、ChAT、ACh、NE、CORT的含量。将标准品和处理后的样本50 μl依次加入微孔板，每孔再加入酶结合物，震荡后37℃孵育，孵育完毕后，弃液并洗涤3次，拍干并用吸水纸微孔壁内残余液体。后依次加入显色剂A、B，避光常温孵育20 min后加入终止液。将终止反应的微孔板置于酶标仪内，使用450 nm波长读取吸光度值，读数在15 min内完成。

1.9统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析、LSD-t检验，Dunnett test检验。

2 结 果

2.1电针对CUMS抑郁大鼠体重和行为学的影响 CUMS造模第21天，各组间大鼠的体重和糖水偏好率有明显差异(P<0.05)，与正常组比较，模型组大鼠体重和糖水偏好率均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，其余各组体重和糖水偏好率差异无统计学意义(P>0.05)。CUMS造模第42天(即干预第21天)，各组间大鼠体重、糖水偏好率、强迫游泳累计不动时间和新环境抑制进食实验延迟进食时间均有显著差异(P<0.05)。与正常组比较，模型组体重和糖水偏好率明显降低，累计不动时间和延迟进食时间显著延长(P<0.05)；与模型组比较，针刺组与东莨菪碱组大鼠的体重和糖水偏好率显著增加，累计不动时间和延迟进食时间明显缩短(P<0.05)，毒扁豆碱组大鼠体重和糖水偏好率显著减少，累计不动时间和延迟进食时间明显延长(P<0.05)；与毒扁豆碱组比较，电针+毒扁豆碱组大鼠体重和糖水偏好率明显增加，累计不动时间和延迟进食时间明显缩短(P<0.05)。见表1、2。

表1 各组大鼠造模和干预期间体重变化及行为学的比较

2.2各组大鼠前额叶内AChE、ChAT、Ach、NE、血清中CORT含量变化的比较 CUMS造模的第42天(干预第21天)，各组间大鼠前额叶AChE、ChAT、ACh、NE、血清中CORT含量有明显差异(P<0.05)。与正常组比较，模型组大鼠前额叶AChE、NE含量均明显下降，ChAT、ACh CORT含量明显升高(均P<0.05)；与模型组比较，电针组大鼠前额叶AChE、NE含量明显升高，ChAT、ACh、CORT含量显著下降(均P<0.05)；毒扁豆碱组大鼠前额叶AChE含量降低，ChAT含量升高，差异均无统计学意义(P>0.05)，ACh、血清中CORT含量明显升高，NE含量明显下降(P<0.05)；与毒扁豆碱组比较，电针+毒扁豆碱组大鼠前额叶AChE、NE含量升高(P<0.05)，ChAT、Ach、血清中CORT含量降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组间大鼠前额叶中AChE、ChAT、Ach、NE、血清中CORT含量变化的比较

3 讨 论

抑郁障碍属中医“郁病”范畴，主因情志过极，五脏气化失常导致气机郁滞，症状表现为情志不遂、郁郁寡欢；而郁滞日久，由“情郁”深入发展为“神郁”，进而神明失司，使道不通，神道不利，神机渐泯，出现自杀等严重症状。因此，“疏肝、理气、调神”是治疗郁病的关键，“疏肝调神”针法主穴常选用百会、印堂、合谷、太冲，其中百会、印堂为督脉穴位，“督脉上脑入巅”，又“脑为元神之府，主持五神”，因而百会配印堂可调神解郁；合谷、太冲二穴名为“四关”“能大开通也”，又合谷为阳经上肢穴位，偏于升发清气，太冲为阴经下肢穴位，偏于降逆泄浊，二穴合用，可使气血畅达，升降有序，上下交济，阴阳平衡。四穴共奏“疏肝、理气、调神”之功。本研究说明“疏肝调神”针法可有效改善CUMS模型大鼠的抑郁样行为。

抑郁障碍的发病机制中，胆碱能过活化致抑郁学说从胆碱能的角度阐释了抑郁障碍的病理机制〔6〕。早在1973年，Janowsky等〔8〕就提出抑郁障碍是胆碱能优势支配的一种疾病，即抑郁的胆碱能过活化学说。国内外研究表明〔13～17〕，抑制ACh的降解，造成突触间隙的ACh蓄积，或促使受体的过量激活，从而诱导抑郁障碍的发生〔13～15，18〕；而促进过活化ACh降解，或拮抗胆碱能受体，可发挥抗抑郁效应。应激作为抑郁障碍病理过程的重要因素，应激反应下HPA轴被激活〔19〕，表现为CORT和皮质酮等物质升高〔20〕。已有研究发现〔13〕，长期应激所致的抑郁状态下CORT水平与胆碱能因子ACh变化呈正相关，表明机体对长期应激的调节与对胆碱能的超敏性有关，机体在长期应激下表现出的抑郁状态与其胆碱能过活化，进而对应激的敏感性增加有关。ACh是由ChAT的催化下由胆碱和乙酰辅酶A合成，随后以胞吐的方式释放至突触间隙，突触间隙的ACh可由AChE降解，AChE是调控胞外ACh水平的关键酶〔6〕。既往研究发现，抑制或者敲除AChE可造成胆碱能系统的过度活化状态，从而诱导抑郁症状〔14,21〕。本研究中，模型组大鼠表现为体重下降、快感缺失、活动力降低和兴趣下降抑郁症状，同时还表现为CORT升高和胆碱能过活化状态。运用胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱干预后的CUMS大鼠表现为加重抑郁症状，其前额叶ACh水平表现亦出升高趋势。结合CORT和NE水平升高的结果，推测胆碱能过活化状态下，抑郁大鼠表现出对压力性应激的超敏性，这可能是导致抑郁状态的加重原因。ACh的降解过程受阻，AChE降解ACh的过程可能有其他生物途径参与〔22〕。本研究结果说明电针可能通过影响ACh的合成或降解过程调控ACh水平，以解除胆碱能过活化状态，从而降低对压力性应激的超敏性，这可能是“疏肝调神”针法治疗抑郁障碍的作用机制。

综上，“疏肝调神”针法可有效改善CUMS抑郁大鼠的抑郁样行为，其作用机制可能参与调控胆碱能代谢，有效解除胆碱能过活化状态，降低机体对应激的易感性而发挥抗抑郁效应。最新研究报道，胆碱能受体在抗抑郁效应的神经生物学机制中发挥着重要作用〔23,24〕。