山羊IL-2基因真核表达质粒构建及在MDBK细胞中的表达

杨 倩，李 婷，鲜思美

1. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2. 贵州省动物疫病研究所，贵州贵阳 550025

白细胞介素-2（Interleukin-2， IL-2），主要由Th1型淋巴细胞分泌，能促进T、B细胞增殖及维持其活性[1]，在IL-2的作用下抗原提呈显著增强，它对其它细胞因子的分泌也有一定的促进作用，是促进机体产生免疫的一类重要细胞因子[2]。通过持续注射一定剂量IL-2，对T细胞分化成熟有一定效果，并能增加外周血中CD4+T细胞的数量，增强机体免疫应答能力。所以，可以把IL-2与亚单位疫苗或核酸疫苗等联用，以作为细胞因子免疫佐剂，增强免疫效果。目前，人源或不同动物来源的IL-2作为细胞因子佐剂已在多种疫病核酸疫苗研究中得到应用[3]。本研究欲构建贵州黑山羊IL-2基因的真核表达质粒，为将pVAX1-IL-2作为核酸疫苗免疫佐剂研究提供生物材料。

1 材料与方法

1.1 主要材料

MDBK细胞、DH5α感受态细胞、阳性质粒pMD19-T-IL-2和pVAX1真核表达质粒均由本实验室保存。HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；IL-2基因ELISA检测试剂盒购自武汉基因美公司；Lipofatamiane 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 引物设计与合成

根据Genbank登录的山羊IL-2基因序列（NM_001287567），利用软件设计一对引物，IL-F：5'-CCCAAGCTTACCACCATGTACAAGCTACAACTCTTG TC-3'，IL-R：5'-CGGAATTCTCAAGTCATTGTTGACTAG ATG-3'，预扩增片段大小为468 bp，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.3 山羊IL-2基因扩增

以pMD19-T-IL-2克隆质粒为DNA模板进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 山羊IL-2基因真核表达质粒的构建及鉴定

将质粒pMD19-T-IL-2及载体质粒pVAX-1经限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切并进行胶回收，回收纯化后的IL-2基因与pVAX1载体利用T4连接酶进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，提取转化成功的单菌落质粒，进行PCR和双酶切鉴定，同时送往上海英潍捷基公司测序。

1.5 山羊IL-2基因真核表达质粒转染MDBK细胞及鉴定

抽提无内毒素pVAX1-IL-2质粒，利用Lipofatamiane 2000将pVAX1-IL-2质粒转染至培养MDBK细胞，转染相同剂量的pVAX1载体空载体对照组，正常细胞为空白对照组。收集转染48 h后的细胞，提取细胞总RNA后进行cDNA合成。以cDNA为模板进行PCR检测。同时收集细胞上清，采用IL-2 ELISA检测试剂盒对上清进行检测。

2 结果

2.1 山羊IL-2基因扩增

IL-2基因扩增结果如图1，条带大小约为468 bp，与预期片段大小相符。

图1 山羊IL-2基因重组克隆质粒PCR扩增结果M，Marker D2000；1.重组质粒PCR产物；2.阴性对照

2.2 pVAX1-IL-2质粒鉴定

构建的重组质粒经PCR和双酶切鉴定正确（图2、图3），鉴定为阳性的重组质粒送往上海英潍捷基公司测序，测序比对正确。表明贵州黑山羊IL-2基因真核表达质粒构建成功，并将其命名为pVAX1-IL-2。

图2 贵州黑山羊IL-2基因重组真核表达质粒PCR 鉴定M.DNA Marker D200; 1: 阴性对照; 2和3: IL-2重组真核表达质粒

图3 贵州黑山羊IL-2基因重组真核表达质粒双酶切鉴定M.Marker D2000;1和2:重组山羊IL-2真核表达质粒双酶切

2.3 pVAX1-IL-2体外转录和表达结果

提取转染后的细胞总RNA进行RT-PCR扩增后，结果显示，空白对照组和空载体组未见IL-2基因扩增，转染了pVAX1-IL-2质粒的细胞总RNA中能扩增出IL-2基因（图4）。同时收集转染后的上清，采用ELISA方法检测pVAX1-IL-2的表达，结果显示pVAX1-IL-2转染组、空载体转染组、空白对照组IL-2表达量分别为112、84.1、72.3pg/mL，pVAX1-IL-2转染组明显高于空白对照组和空载体组，表明pVAX1-IL-2在MDBK细胞中的表达量较高。

图4 真核表达质粒pVAX1-IL-2在细胞中mRNA转录结果 M.Marker D2000; 1.pVAX1-IL-2转染; 2.空载体组；3. 空白对照组

3 讨论

Morgan等最先在小鼠脾脏细胞上清液中发现一种能促进胸腺细胞生长的因子，由于其独特功能，后命名为IL-2。经过多年相关科研人员的研究证明IL-2不仅仅对T细胞的增殖和分化起作用，还具有多方面的生物活性[4]。少剂量注射IL-2可促进CD4+T的产生，因此与疫苗合用时可增强疫苗的免疫效果。为取得较好的免疫效果，可通过将IL-2与目的基因构建融合质粒后注射或单独注射IL-2真核表达质粒[5]。本试验以山羊IL-2为研究对象运用基因重组技术，构建真核表达质粒pVAX1-IL-2，作为核酸疫苗的细胞因子佐剂的应用研究奠定了基础。