MLL5基因敲除对小鼠结肠癌CT26细胞移植瘤生长的影响及其机制

石秀珍，高玮，徐萍[上海交通大学医学院附属松江医院（筹）消化内科，上海201600]

混合谱系白血病5（mixed lineage leukemia 5,MIL5）基因属于TrxG基因家族，是重要的表观遗传学调控基因和人急性髓细胞性白血病的重要致病基因[1]。MLL5诱导组蛋白H3K4转移酶参与肿瘤的广泛生物学过程[2]。有研究结果[3-5]表明，MLL5基因缺失的小鼠会导致造血干细胞（hemopoietic stem cell，HSC）的自我更新能力受损，并引起HSC中DNA损伤和活性氧积累[6]。此外，MLL5在固有免疫中也起重要作用，参与视黄酸诱导基因1（retinoic acid inducible gene-1，RIG-1）蛋白和E3泛素连接酶STUB1之间的相互作用，MLL5基因缺失直接减弱RIG-1和STUB1的相互作用，降低RIG-1泛素化，增加RIG-1蛋白表达水平[7]。有趣的是，RIG-1在结肠癌的肿瘤免疫中起重要作用，DDX58基因缺失后的黑色素瘤B16细胞和结肠癌CT26细胞抵抗CTLA-4单抗治疗作用，而激活RIG-1可以显著缩小B16和CT26细胞移植瘤体积并延长荷瘤小鼠总生存期（OS）[8-10]。然而，MLL5在结肠癌中的作用及其机制尚未明了。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLL5基因缺失及MLL5和DDX58双基因缺失的结肠癌CT26细胞模型，并将其接种到野生型BALB/c小鼠和免疫缺陷型NSG小鼠皮下，观察移植瘤的生长及荷瘤小鼠的OS，以期确定MLL5在小鼠结肠癌及肿瘤免疫中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系、实验动物及主要试剂

人胚肾上皮细胞系293T 和小鼠结肠癌细胞系CT26购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。6 周龄、雄性野生型BALB/c 小鼠和NSG 小鼠（动物合格证：20170005023369）购于上海斯莱克公司。

PBS缓冲液、DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基、Opti-MEM培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液均购于美国Gibco公司，FastDigestEsp3Ⅰ、转染试剂Lipofectamine 2000购于美国Thermo公司，助慢病毒感染试剂聚凝胺polybrene购于美国Sigma公司，无内毒素质粒中量提取试剂盒购于天根生化科技有限公司，pSPAX、pMD2.G、lentiCRISPRv2 和lentiGuide-BSD质粒购于美国Addgene公司，Stbl3感受态购于唯地生物公司，兔抗鼠RIG-1购于Proteintech公司，兔抗鼠MLL5 购于美国Active Motif公司，兔抗鼠β-actin购于Abclonal公司，荧光羊抗兔IgG二抗购于美国LI-COR公司。

1.2 CRISPR/Cas9载体构建、包装和慢病毒合成及感染

利用http://crispr.mit.edu/网站在线工具，设计靶向MLL5和DDX58的sgRNA。MLL5-sgRNA1#引物序列：上游为5'-CACCGATGTAACCAGGTGCATATG-3'，下游为5'-AAACCATATGCACCTGGTTACATC-3'；MLL5-sgRNA2# 引物序列：上游为5'-CACCGATGC TCATGACGTTCGCCTC-3'，下游为 5'-AAACGA GGCGAACGTCATGAGCATC-3'；DDX58-sgRNA1#引物序列：上游为5'-CACCGCGTTGGAGATGCT AAGACCG-3'，下游为5'-AAACCGGTCTTAGCA TCTCCAACGC-3'；DDX58-sgRNA2#引物序列：上游为5'-CACCGTCCGCCAGAGATGAACGAAG-3'，下游为5'-AAACCTTCGTTCATCTCTGGCGGAC-3'；NTCsgRNA 引物序列：上游为5'-CACCGGCGAGGTATT CGGCTCCGCG-3'，下游为5'-AAACCGCGGAGCCGA ATACCTCGCC-3'。

LentiCRISPRv2和lentiGuide-BSD慢病毒质粒经Esp3Ⅰ酶切后琼脂糖凝胶电泳回收，磷酸化退火引物，将退火后的MLL5-sgRNA、DDX58-sgRNA 和NTC-sgRNA DNA片段连接到lentiCRISPRv2 或lentiGuide-BSD 载体上。连接反应体系如下：50 ngEsp3Ⅰ酶切的lentiCRISPRv2 或lentiGuide-BSD 线性化质粒、0.1 pmol/L 磷酸化退火片段、5 μL 2×Quick DNA ligase（DNA连接酶）Buffer、1 μL Quick DNA ligase 在室温连接10 min[11]。连接产物转化Stbl3 大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆测序验证。按照无内毒素质粒中量提取试剂盒说明书抽提质粒。

将293T细胞接种到100 mm培养皿（3×106个/皿），置于37 ℃、5%CO2培养箱中过夜。按照Lipofectamine 2000说明书进行转染，每个培养皿的质粒用量为7.5 μg lentiCRISPRv2 sgRNA或lentiGuide-BSD sgRNA质粒、5 μg pSPAX2和2.5 μg pMD2.G，Lipofectamine 2000∶质粒为2∶1。转染24 h时更换新鲜培养基，48 h后收集含有慢病毒的上清液。

1.3 基因敲除CT26细胞系的建立

将小鼠结肠癌CT26细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素的RPMI 1640完全培养基中培养。将对数生长期的CT26 细胞消化后，接种到24 孔板（3×104个/孔）中，第2 天吸去培养液，加入用RPMI 1640 完全培养基1∶1 稀释的lentiCRISPRv2-MLL5 sgRNA 或lentiCRISPRv2-NTC sgRNA慢病毒，并加入终质量浓度8 μg/mL慢病毒助感染试剂polybrene，混匀后置于37 ℃培养箱培养24 h时换新鲜RPMI 1640完全培养基。感染48 h时，加入含有20 μg/mL 嘌呤霉素的RPMI 1640 完全培养基，筛选被感染的细胞。筛选48 h后未感染病毒的对照组细胞全部死亡，消化细胞并利用稀释法接种到96孔板，标记单细胞孔，待单克隆细胞扩增后检测MLL5蛋白的表达，另外提取单克隆细胞株基因组通过PCR 扩增MLL5 sgRNA 靶向基因区域序列进行Sanger测序。

利用MLL5 sgRNA1#克隆系同上述步骤感染lentiGuide-BSD-DDX58 sgRNA1#、lentiGuide-BSDDDX58 sgRNA2#或lentiGuide-BSD-NTC sgRNA 病毒，挑取MLL5和RIG-1双基因缺失的克隆细胞系用于MLL5调控RIG-1的研究。

1.4 WB法检测CT26细胞中MLL5、RIG-1蛋白表达

收集各组细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃、12 000×g离心15 min后取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。用10%SDS-PAGE分离蛋白质，将蛋白质转移至NC 膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入MLL5（1∶1 000）、RIG-1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃过夜。TBST洗涤3次（10 min/次），加入羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室温下处理1 h，洗膜后用CLX Odyssey LICOR双色红外激光成像系统扫描并成像，利用Image Studio软件分析蛋白条带的灰度值。实验重复3次。

1.5 结肠癌CT26细胞移植瘤小鼠模型的建立和观察

BALB/c 小鼠和NSG 小鼠饲养于SPF（无特定病原体）级动物房，温度维持22 ℃，相对湿度30%～70%，人工照明，昼夜明暗12 h 交替。所有实验动物相关的操作均经上海市松江区中心医院实验动物伦理委员会审核并批准。

将NSG小鼠和BALB/c小鼠分别随机分成3组：Control sgRNA 组、MLL5 sgRNA1# 组 和MLL5 sgRNA2#组，8只/组。将24只BALB/c小鼠随机分为3 组：Control sgRNA 组、MLL5 sgRNA1#+DDX58 sgRNA1#组和MLL5 sgRNA1#+DDX58 sgRNA2#组。将处于对数生长期的CT26 细胞消化制备成细胞悬液，用不含血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为2×106个/mL。取100 μL细胞悬液接种到小鼠背部皮下，每只小鼠细胞接种量为2×105个。从接种第7 天起，每3 d 监测肿瘤块体积一次，用游标卡尺测量肿瘤块最长和最短直径，计算肿瘤体积。肿瘤体积=（瘤体长径×瘤体短径2）/2。当最长径达到15 mm 时达到伦理终点，将小鼠安乐死，以获取移植瘤标本。

1.6 统计学处理

采用Origin 9 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量数据以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建敲除MLL5基因的CT26细胞系

Sanger 测序检测结果（图1A）显示，MLL5 sgRNA1#单克隆CT26细胞系基因组中MLL5基因分别缺失2 bp和插入1 bp；MLL5 sgRNA2#单克隆分别缺失4 bp 和1 bp。WB 法检测结果（图1B）显示，MLL5 sgRNA1#和MLL5 sgRNA2#单克隆细胞均不表达MLL5蛋白。结果表明，成功构建MLL5基因敲除的结肠癌CT26细胞系，可以用于后续实验。

图1 Sanger测序（A）和WB法（B）验证MLL5基因敲除效果

2.2 MLL5基因缺失上调CT26细胞中RIG-1表达水平

WB实验结果（图2）显示，MLL5 sgRNA1#和MLL5 sgRNA2#组CT26细胞中RIG-1水平显著高于Control sgRNA组CT26细胞（均P<0.01）。结果表明，MLL5基因敲除可显著上调CT26细胞中RIG-1蛋白的表达水平。

图2 WB法检测MLL5基因敲除后CT26细胞中RIG-1蛋白的表达

2.3 MLL5 基因敲除抑制野生型小鼠CT26 细胞移植瘤的生长并延长OS

小鼠荷瘤实验结果显示，在免疫缺陷NSG 小鼠中Control sgRNA 和MLL5 sgRNA CT26 细胞移植瘤体积比较差异无统计学意义（图3A），而在野生型BALB/c小鼠中MLL5 sgRNA1#和MLL5 sgRNA2#组CT26 细胞移植瘤的体积显著小于Control sgRNA 组（均P<0.01，图3B）。同样，MLL5 基因敲除对种植CT26 细胞的NSG 小鼠的OS 无显著影响（图3C），而在野生型小鼠中CT26细胞敲除MLL5基因可以显著延长荷瘤小鼠的OS率（图3D）。实验结果表明，在小鼠结肠癌CT26 细胞移植瘤模型中，MLL5 基因敲除可增强野生型小鼠对CT26细胞移植瘤的免疫作用。

图3 MLL5基因敲除对各组裸鼠CT26细胞移植瘤体积（A、B）和荷瘤小鼠OS率（C、D）的影响

2.4 CT26细胞缺失MLL5增强肿瘤免疫依赖于RIG-1

MLL5 基因敲除可增强肿瘤免疫而显著抑制野生型BALB/c小鼠CT26细胞移植瘤的生长和延长荷瘤小鼠的OS。为验证MLL5基因敲除是否通过提高RIG-1 表达水平而增强肿瘤免疫，在MLL5 sgRNA1#CT26 细胞中同时敲除DDX58 基因后，WB法检测结果（图4A）显示，DDX58 sgRNA1#和DDX58 sgRNA2#敲除成功。将Control sgRNA、MLL5 和DDX58 双基因缺失的CT26 细胞接种于野生型BALB/c 小鼠，结果显示Control sgRNA、MLL5 sgRNA1# +DDX58 sgRNA1# 和MLL5 sgRNA1# +DDX58 sgRNA2#三组小鼠CT26 细胞移植瘤体积和小鼠的OS 差异比较均无统计学意义（均P>0.05，图4B、C）。实验结果表明，MLL5基因敲除增强肿瘤免疫依赖于RIG-1。

图4 同时敲除MLL5和DDX58基因对RIG-1表达（A）、CT26细胞移植瘤体积（B）和荷瘤小鼠OS率（C）的影响

3 讨论

结肠癌是消化道中常见的恶性肿瘤之一，在中国以41～65岁人群发病率最高，其发病率和病死率均呈逐年上升趋势[12]。目前结肠癌仍以手术为主，但复发率高，初诊已是转移患者的5年OS率不到10%[13]。近年来，免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段，其中靶向免疫检查点程序性死亡蛋白-1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）已经被证明是一种有效的治疗方法[14-15]。临床上，抗PD-1单抗纳武单抗和派姆单抗被用于治疗结直肠癌患者，在部分结直肠癌亚型患者中具有较高的免疫应答率[16-17]。但是单纯的抑制免疫检查点疗法仅对部分结直肠癌亚型患者表现出良好的免疫应答率，而大部分患者免疫应答率仍然较低，因此仍需要研究新的免疫治疗靶点以降低癌细胞的免疫逃逸和免疫耐受。本研究结果发现，敲除小鼠结肠癌CT26 细胞中MLL5 基因后可以上调RIG-1 水平，提高移植瘤的肿瘤免疫，提示MLL5可能成为结肠癌免疫治疗的新靶点。

MLL5 通过促进RIG-1 降解而加强在宿主抗病毒免疫反应中的负调控作用，位于细胞质中的MLL5通过与RIG-1 和RIG-1 的E3 连接酶STUB1 结合，促进K48 连接多泛素化和RIG-1 的蛋白酶体降解[7,18]。MLL5 基因缺失减弱了RIG-1 和STUB1 之间的相互作用并减少了K48连接的多泛素化，从而增加细胞中RIG-1 的积累。MLL5 基因缺失促进体内外INF-α、促炎细胞因子的产生以及对RNA病毒的天然抗病毒免疫应答[19]；在病毒感染后，MLL5 从细胞核转移到细胞质中，以诱导STUB1 介导的RIG-I 降解[7]。本研究结果发现，MLL5 基因缺失后小鼠结肠癌CT26 细胞中RIG-1水平显著提高，其通过增强肿瘤免疫而抑制CT26细胞移植瘤的生长。

在NSG小鼠中，MLL5基因缺失和野生型小鼠结肠癌CT26 细胞移植瘤的生长速度以及荷瘤小鼠的OS 比较差异无统计学意义，说明MLL5 基因缺失对CT26细胞的增殖没有显著性影响。在免疫系统正常的野生型小鼠中，MLL5 基因缺失的结肠癌CT26 细胞移植瘤的生长速度显著低于野生型细胞移植瘤，同样MLL5 基因缺失的CT26 细胞荷瘤小鼠的OS 显著延长，说明MLL5基因缺失的抗肿瘤作用依赖于小鼠免疫系统。然而，MLL5 和RIG-1双基因缺失后又显著逆转MLL5基因缺失的作用，因此MLL5基因缺失通过上调RIG-1水平而增强野生型小鼠对CT26细胞移植瘤的免疫作用。

综上所述，本研究发现MLL5基因缺失可上调结肠癌CT26 细胞中RIG-1 水平，增强野生型小鼠肿瘤免疫、抑制移植瘤生长并延长荷瘤小鼠OS。本研究采用的MLL5 基因缺失的CT26 细胞仅在NSG 小鼠和BALB/c 野生型小鼠中验证，未能在MLL5 基因缺失的小鼠中验证。因此MLL5 能否成为结肠癌治疗的新靶点还需进一步研究。