miR-17-5p通过靶向SETD2调控骨髓增生异常综合征SKM-1细胞的增殖与凋亡

张永晓，李英华（衡水市人民医院 血液内科，河北 衡水 053000）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一种异质性血液系统恶性肿瘤，以细胞减少为特征并伴有转化为急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）的危险[1-2]。miRNA 是一类长度为18～22 个核苷酸的非编码微小RNA，通过与3′UTR不完全碱基互补配对在转录后抑制靶基因的表达，导致靶基因mRNA 的翻译阻滞[3-4]。miRNA 广泛参与人类多种疾病的发生与发展，其中包括MDS[5-6]。miR-17-5p作为miR-17家族成员之一，参与调节神经母细胞瘤、AML 和MDS 等多种肿瘤的进展[7-9]。有研究结果[10]显示，含SET结构域蛋白2（SET domain containing 2，SETD2）参与AML的发病机制，虽其在MDS 中的作用也有相关报道，但其潜在的调控机制仍尚未明了。本课题观察MDS 患者骨髓中miR-17-5p 和SETD2 的表达，探讨MDS 细胞SKM-1中干预miR-17-5p、过表达SETD2、干预SETD2 处理后细胞的增殖与凋亡水平，以揭示miR-17-5p 调控MDS细胞增殖与凋亡的机制，为临床MDS的精准治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞系及主要试剂

收集2019 年3 月至2021 年5 月衡水市人民医院就诊的35例MDS患者的骨髓组织标本，患者确诊依据为《骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南》（2019 年版），标记为MDS 组，所有患者均为未进行任何治疗的初诊原发性MDS。同时收集35 例健康体检者的骨髓组织标本，标记为对照组。所有标本采集前均告知患者并签署知情同意书。MDS细胞系SKM-1来自本医院。

CCK-8 试剂盒购自日本同仁公司，Annexin Ⅴ/FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自日本TaKaRa 公司，LipofectamineTM3000 转染试剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，兔抗SETD2、cleaved caspase-3（C-caspase-3）、C-caspase-9 抗体购自上海艾博抗（Abcam）贸易有限公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自北京博尔西科技有限公司，实验中所有引物、核酸序列均由上海吉玛基因股份有限公司提供。

1.2 细胞培养、分组与转染

将SKM-1细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，每2 d更换一次培养液。

将培养48 h的SKM-1细胞分为NC组（不做任何处理）、si-miR-17-5p 组（转染si-miR-17-5p mimic）、si-miR-CN 组（转染si-miR-CN）、miR-17-5p 组（转染miR-17-5p mimic）、miR-CN 组（转 染miR-NC）、pcDNA 组（转染pcDNA）、pcDNA-SETD2 组（转染pcDNA-SETD2）、si-SETD2 组（转染siSETD2）、si-NC（转染siRNA）、si-miR-17-5p+si-CN 组（共转染si-miR-17-5p 和si-CN）、si-miR-17-5p+si-SETD2 组（共转染 si-miR-17-5p和si-SETD2）。按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书方法，将各个重组质粒转染至SKM-1 细胞中，转染12 h 时更换新鲜培养液。qPCR 或WB 实验检测转染效率，确定转染成功后方可进行后续研究。

1.3 qPCR法检测SKM-1细胞中miR-17-5p 和SETD2 mRNA的表达

用RNA抽提试剂盒提取各组待检测细胞中总RNA，再用逆转录试剂逆转录成cDNA，最后用qPCR试剂盒检测cDNA中miR-17-5p、SETD2 mRNA的表达水平。引 物 序 列:miR-17-5p F 为5′-TCTAGATCCCGA GGACTG-3′，R为5′-ATCGTGACCTGAACC-3′；SETD2 F 为5′-AACGGGAGGCTCAGAAACAA-3′，R 为5′-GTGGGTAACCAGCAAAGGGA-3′；U6 F 为5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′，R 为5′ -CCAAGC TTATGACAGCCATCATC -3′ ；GAPDH F 为 5′-TGAGATCAACGTGTTCCAGTG-3′，R 为5′-ACC AGATGAAATG TGCCCC-3′。qPCR反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共进行41个循环；最后72 ℃保持5 min。以U6、GAPDH 为内参，以2-△△Ct法计算miR-17-5p 和SETD2 mRNA的相对表达量。

1.4 WB 法检测SKM-1 细胞中SETD2、C-caspase-3和C-caspase-9的表达

取各组对数生长期细胞，用RIPA 细胞裂解液冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白。对蛋白进行定量、变性处理，离心取上清用于蛋白电泳上样，进行10%SDS-PAGE，将蛋白质转移至PVDF膜上，用含有2.5%脱脂奶粉的封闭液37 ℃下处理2 h。将PVDF膜浸入稀释的兔抗SETD2（1∶1 000）、C-caspase-3（1∶1 000）、C-caspase-9（1∶1 500）、β-actin（1∶800）一抗中，4 ℃下处理过夜。次日，充分清洗后，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶500），37 ℃下处理2 h。清洗后，用ECL电化学发光法显影、曝光。ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。

1.5 CCK-8法检测SKM-1细胞的增殖能力

将各组细胞密度调整至1×105个/mL，取100 μL加入96 孔板中，依次加入20 μL CCK-8 溶液，分别在24、48和72 h时，上酶标仪检测490 nm波长处每孔的光密度（D）值，以D值表示细胞的增殖能力。

1.6 流式细胞术检测SKM-1细胞的凋亡水平

将各组细胞用600 μL 结合缓冲液悬浮后，依次加入Annexin Ⅴ/FITC、PI染色液各5 μL，避光下放置20 min 后，快速上流式细胞仪检测SKM-1 细胞的凋亡率。细胞总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-17-5p 与SETD2的靶向关系

通过TargetScan 软件预测miR-17-5p 与SETD2之间存在的互补结合位点。将含有野生型（WT）或突变型（MUT）SETD2 3'UTR 中含miR-17-5p 结合位点的核苷酸序列克隆到pGL3 荧光素酶报告质粒载体。将对数生长期SKM-1细胞接种在24孔板（2×105个/孔），然 后 用LipofectamineTM3000 将miR-17-5p mimic、miR-NC 与WT 或MUT报告质粒共转染至SKM-1 细胞，继续培养48 h，使用双荧光素酶试剂盒测定细胞的荧光活性。

1.8 统计学处理

qPCR、WB、CCK-8 和流式细胞术等实验均重复3 次。采用SPSS22.0 统计学软件对实验数据进行处理。符合正态分布的计量数据以表示，两组数据间比较采用独立样本t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析，miR-17-5p与SETD2 mRNA表达之间的关系采用Pearson相关性分析，以P<0.05或P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS 骨髓组织中miR-17-5p 高表达而SETD2 mRNA低表达

qPCR 和WB 法检测结果显示，与对照组相比，MDS 骨髓组织中miR-17-5p 表达水平显著升高（11.65±4.69vs1.00±0.32，t=13.403，P<0.01），SETD2 mRNA 和蛋白表达均显著降低（0.41±0.22vs1.00±0.34，t=8.619，P<0.01；0.21±0.07vs0.68±0.14，t=9.008，P<0.01；图1A）。Pearson 相关性分析结果（图1B）显示，MDS骨髓组织中miR-17-5p 表达与SETD2 mRNA表达之间呈显著负相关（r=-0.546，P<0.01）。

图1 MDS骨髓组织中SETD2表达（A）和miR-17-5p与SETD2 mRNA表达的相关性分析（B）

2.2 干扰miR-17-5p可抑制SKM-1细胞的增殖能力

CCK-8 法检测结果显示，与NC 组和si-miR-NC组相比，si-miR-17-5p 组SKM-1 细胞中miR-17-5p表达显著降低（0.24±0.05vs1.00±0.07、0.98±0.12，F=234.349，P<0.01）；在转染24、48 和72 h 时，细胞增殖能力均显著降低（t24h：0.32±0.04vs0.39±0.04、0.38±0.05，F=6.789，P<0.01；t48h：0.45±0.05vs0.67±0.08、0.65±0.06，F=31.968，P<0.01；t72h：0.73±0.09vs1.12±0.13、1.14±0.14，F=32.348，P<0.01）。结果表明，干扰miR-17-5p 表达可显著降低SKM-1 细胞的增殖能力。

2.3 干扰miR-17-5p可诱导SKM-1细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，与NC 组和si-miR-NC组相比，si-miR-17-5p 组SKM-1 细胞凋亡率显著升高[（13.36±2.54）%vs（3.26±0.60）%、（3.46±0.69）%，F=123.533，P<0.01 ；图2A] 。WB法检测结果显示，si-miR-17-5p 组SKM-1细胞中C-caspase-3、C-caspase-9 表达水平显著升高（0.37±0.05vs0.15±0.03、0.13±0.04，F=95.760，P<0.01；0.43±0.07vs0.08±0.03、0.11±0.04，F=137.311，P<0.01；图2B）。结果表明，干扰miR-17-5p表达可诱导SKM-1细胞凋亡。

图2 干扰miR-17-5p对SKM-1细胞凋亡（A）及其相关蛋白表达（B）的影响

2.4 miR-17-5p靶向调控SETD2表达

通过预测软件TargetScan 预测到miR-17-5p 与SETD2之间存在连续6个互补的核苷酸结合位点（图3A）。双荧光素酶报告基因实验结果（图3B）显示，与miR-NC 组相比，转染miR-17-5p mimic 后，WT 组细胞的荧光素酶活性显著降低（t=13.389，P<0.01），而MUT组细胞的荧光素酶活性变化不显著（t=0.651，P>0.05）。WB 法检测结果显示，与miR-NC 组相比，miR-17-5p mimic组细胞中SETD2蛋白表达显著降低（0.06±0.01vs0.24±0.05，t=10.590，P<0.01）；与si-miRNC组相比，si-miR-17-5p mimic组细胞中SETD2蛋白表达显著升高（0.43±0.07vs0.21±0.05，t=7.672，P<0.01；图3C）。结果表明，miR-17-5p 靶向负调控SETD2蛋白的表达。

图3 SKM-1细胞中miR-17-5p靶向调控SETD2的表达

2.5 过表达SETD2 可降低SKM-1 细胞的增殖活力并促进细胞凋亡

转染pcDNA-SETD2后，WB、CCK-8和流式细胞术检测结果（表1和图4）显示，与NC组和pcDNA组相比，pcDNA-SETD2组SKM-1细胞中SETD2 蛋白表达显著升高（均P<0.01），转染后24、48和72 h时细胞增殖活力均显著降低（均P<0.01）、细胞凋亡率显著升高（P<0.01），细胞中C-caspase-3 和C-caspase-9 表达均显著升高（均P<0.01）。结果表明，过表达SETD2 可明显降低SKM-1细胞的增殖能力并促进细胞凋亡。

表1 过表达SETD2对SKM-1细胞增殖、凋亡及其相关蛋白表达的影响

图4 过表达SETD2对SKM-1细胞凋亡（A）及SETD2、C-caspase-9和C-caspase-3表达（B）的影响

2.6 沉默SETD2 可部分逆转干扰miR-17-5p 对SKM-1细胞的增殖抑制和凋亡促进作用

转染si-miR-17-5p后，WB、CCK-8法和流式细胞术检测结果（表2和图5）显示，与si-miR-NC组相比，si-miR-17-5p 组细胞中SETD2 蛋白表达显著升高（P<0.01）；在24、48和72 h时细胞的增殖能力均显著降低（均P<0.01），细胞凋亡率显著升高（P<0.01），细胞中C-caspase-3 和C-caspase-9 表达均显著升高（均P<0.01）；与si-miR-17-5p+si-NC组相比，si-miR-17-5p+si-SETD2组细胞中SETD2蛋白的表达水平显著降低（P<0.01），在24、48、72 h 细胞增殖能力均显著升高（均P<0.01），细胞凋亡率显著降低（P<0.01），C-caspase-3 和C-caspase-9 表达均显著降低（均P<0.01）。结果表明，沉默SETD2 可部分逆转干扰miR-17-5p对SKM-1细胞的增殖抑制、凋亡促进作用。

图5 同时干扰SETD2和miR-17-5p对SKM-1细胞凋亡（A）及其相关蛋白表达（B）的影响

表2 同时干扰SETD2和miR-17-5p对SKM-1细胞增殖和凋亡及其相关蛋白表达的影响

3 讨论

MDS是一种以造血功能低下为特征的克隆性干细胞疾病，具有向AML 转化的高风险[11]。miRNA 在多种肿瘤中作为抑癌基因或致癌基因发挥其作用，调控细胞的增殖与凋亡[12-14]，也可能在MDS的发生发展中起重要作用。近期的研究结果[15]显示，miR-17-5p作为lncRNA HOTAIR 在AML 中表达异常升高并促进AML细胞的分化，其机制为靶向抑制下游miR-17-5p表达而上调p21。HE等[16]研究发现，miR-17/20a参与缺氧诱导因子1 介导的MDS 细胞的分化过程。VASILATOU 等[17]研究发现，miR-17-5p 在高危MDS患者中的表达水平显著高于低危MDS 患者，并且其表达水平与MDS患者的总生存率有关。本研究结果发现，miR-17-5p 在MDS 骨髓组织中高表达，这与前述研究者的研究结论相一致。为了探究miR-17-5p参与MDS 发展的调控机制，研究者[18]还检测了干扰miR-17-5p表达对MDS细胞增殖与凋亡的影响，结果发现干扰miR-17-5p 表达显著抑制MDS 细胞的增殖并促进细胞凋亡，同时还下调凋亡相关蛋白C-caspase-3和C-caspase-9的表达。研究结果揭示了miR-17-5p 在MDS 发生发展过程中起重要作用。进一步研究发现，SETD2 在MDS 中作为miR-17-5p的靶基因而表达失调，这也许与miR-17-5p 在MDS中的调控作用存在一定的相关性。

MDS 发展为AML 与基因突变有关。据报道[18]，含有2 个SETD2 变异体的SET 结构域为AML 患者预后不良的危险因素。但是SETD2 在MDS 中的作用机制仍有待深入研究。LI 等[19]研究发现，SETD2基因低表达与MDS 患者不良预后密切相关，并且其可通过上调骨髓细胞中散乱蛋白3的表达促进MDS转化为AML。CHEN 等[20]也报道，SETD2 在MDS 中低表达与患者生存期缩短显著相关，其具有促进MDS 向AML 转化的功能，提示SETD2 是治疗MDS转化为AML 的潜在靶点。上述研究结果均表明，SETD2 在MDS 中扮演致病基因的角色。本研究结果发现，SETD2 在MDS 中呈显著低表达，这与上述研究者的研究结果相一致。此外本研究还发现，过表达SETD2的MDS细胞增殖能力显著下降、凋亡能力明显增强，而沉默SETD2 却可以显著逆转干扰miR-17-5p 对MDS 细胞增殖抑制和凋亡促进作用。研究结果说明，不仅miR-17-5p 可负向调控SETD2在MDS 组织中的表达，SETD2 也具有逆向调控miR-17-5p表达的作用。

综上所述，本研究结果表明MDS骨髓中miR-17-5p高表达，其作用是调控MDS 细胞的增殖与凋亡能力，产生这种作用的机制与miR-17-5p 靶向负调控SETD2相关，此结果为MDS的治疗提供了新的靶点。