miR-502-3p通过靶向GTPBP2基因调控结直肠癌干细胞增殖与凋亡

柯超，周红见，蒋斌，谢兴旺，张超（武汉市第三医院 胃肠腹壁与疝外科，湖北 武汉 430061）

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。关于结直肠癌的治疗方法以外科手术、放疗等为主，虽然提高了患者5 年生存率，但是其远处转移、复发等仍影响患者的治疗效果[1-2]。肿瘤干细胞具有自我更新、多向分化、耐药、高度致瘤等特性，被认为是肿瘤发生、转移和复发的种子细胞[3]。目前，众多学者致力于研究肿瘤干细胞和miRNA 调控作用，包括如何有效地抑制肿瘤干细胞的发展，以达到治疗肿瘤的目的[4-5]。研究结果[6]显示，miRNA（如miR-19、miR-501-5p和miR-744）与肿瘤干细胞发展有关。miR-502-3p在胃癌、肺癌等肿瘤中表达失调，与肿瘤细胞增殖、凋亡等有关[7-8]，但是对结直肠癌干细胞（colorectal cancer stem cell，CCSC）的研究报道尚不清楚。GTP结合蛋白2（GTP-binding protein 2，GTPBP2）是蛋白质合成GTP酶超家族成员，广泛存在于人体的胰腺、胃、小肠等，且表达水平较高[9]，关于GTPBP2 对CCSC的作用机制尚不明确。鉴于此，本课题用免疫磁珠实验从结直肠癌HCT116 细胞中分选出CCSC，探讨miR-502-3p 是否通过调控GTPBP2 基因影响CCSC 增殖、周期和凋亡的分子机制，旨在为结直肠癌诊断和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

结直肠癌细胞HCT116购于中科院上海细胞库。胎牛血清、RPMI 1640培养基购于上海联硕生物科技有限公司，表皮生长因子（bFGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购于美国Pepro Tech公司，小鼠抗人CD133和CD44 抗体购于德国Miltenyi 公司，Lipofectamine 2000 试剂盒购于上海研卉生物科技有限公司，miR-NC、miR-502-3p、si-miR-NC、si-miR-502-3p、空载体vector、GTPBP2 过表达载体和引物由上海生工公司设计合成，TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR（qPCR）试剂盒购于日本TaKaRa 公司，MTT试剂盒、BCA试剂盒、电化学发光液购于北京索莱宝公司，细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于江苏凯基生物公司，Ki67抗体、CDK1抗体、Bcl2抗体、BAX 抗体、GTPBP2 抗体、GAPDH 抗体购于美国Abcam 公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG、荧光素酶报告基因检测试剂盒购于艾美捷科技有限公司。

1.2 细胞培养和分选

结直肠癌HCT116 细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞生长汇合度达85%时，加入胰酶进行消化并制备细胞悬液。将结直肠癌细胞接种于含有2%B27、20 µg/L EGF、20 µg/L bFGF、不含血清的完全培养基中进行培养，观察细胞成球情况，用第3代细胞与小鼠抗人CD133 和CD44 抗体包被的磁珠进行培养，采用流式细胞术分选出双阳性细胞（CD133+CD44+）和双阴性细胞（CD133-CD44-）。并检测CD133+CD44+细胞的表达率。

1.3 细胞转染及分组

将CD133+CD44+细胞接种至6 孔板中（2×105个/孔），参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书的方法将miR-NC、miR-502-3p、si-miR-NC、si-miR-502-3p、miR-502-3p+vector 和miR-502-3p+GTPBP2 转 染 至CD133+CD44+细胞中，分别记为miR-NC组、miR-502-3p组、si-miR-NC 组、si-miR-502-3p 组、miR-502-3p+vector组和miR-502-3p+GTPBP2组。转染6 h后更换细胞培养液，培养48 h后进行后续实验。

1.4 qPCR法检测CCSC 中miR-502-3p 和GTPBP2 mRNA的表达

取CD133-CD44-细胞和CD133+CD44+细胞，以及转染成功的各组细胞按照TRIzol法提取细胞中总RNA，检测浓度和纯度后，逆转录合成cDNA，将cDNA 根据qPCR 试剂盒说明书步骤进行PCR 扩增反应。引物序列：miR-502-3p 上游为5′-ACACTC CAGCTGGGAATGCACCTGGGCAAGG-3′，下游为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游为5′-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3′ ；GTPBP2上游为5′-CTG GCTGAGGAGGAAATG-3′，下游为5′-CACACG GAGGTCTAGGAAC-3′；GAPDH上游为5′-GAA GGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游为5′-GAAGAT GGTGATGGGATTTC-3′。PCR反应条件：预变性95℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共循环35次。以U6、GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-502-3p和GTPBP2 mRNA的相对表达量。

1.5 MTT法检测CCSC的增殖率

将各组CD133+CD44+细胞接种至96孔板中（5×103个/孔），继续培养48 h，每孔加入10 μL MTT试剂，继续培养4 h，清除培养液，每孔加入150 μL DMSO试剂。酶标仪检测波长490 nm处每孔光密度（D）值，计算细胞增殖率（实验组D值/对照组D值×100%）。

1.6 流式细胞术检测CCSC细胞周期和凋亡水平

细胞周期实验：将miR-NC 组、miR-502-3p 组、miR-502-3p+vector 组、miR-502-3p+GTPBP2 组CD133+CD44+细胞接种至6孔板中（5×105个/孔），PBS清洗后，1 200×g离心5 min后收集上清液，加入乙醇溶液，固定过夜。弃去乙醇溶液，加入PI和RNA酶，避光反应15～30 min，上流式细胞仪检测细胞周期变化。

细胞凋亡实验：取各组CD133+CD44+细胞（同细胞周期实验），离心后弃去上清液，采用预冷PBS 进行清洗，加入PBS重悬细胞，然后与各5 μL的Annexin Ⅴ-FITC和PI染液混匀，避光反应15～30 min，置于流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.7 WB 法检测CCSC 中Ki67、CDK1、Bcl2、BAX 和GTPBP2蛋白的表达

取各组CD133+CD44+细胞用蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，水浴煮沸反应5 min，以每孔35 μg蛋白上样，行SDS-PAGE，用半干法转移分离的蛋白质至PVDF 膜上，在含5%脱脂奶粉溶液中封闭2 h，在均以1∶1 000 稀释的Ki67、CDK1、Bcl2、BAX、GTPBP2和GAPDH一抗中4 ℃过夜。次日在1∶2 500稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗室温下处理2 h，加入电化学发光液显色，曝光。以GAPDH 作为内参，应用凝胶成像软件扫描，分析蛋白条带的灰度值。

1.8 双荧光素酶报告基因实验验证miR-502-3p 与GTPBP2的靶向关系

通过TargetScan 软件预测miR-502-3p 和GTPBP2 之间是否存在互补核苷酸序列。将含有miR-502-3p 结合位点的GTPBP2 3′UTR 序列克隆至荧光素酶报告基因质粒中，构建GTPBP2 野生型（GTPBP2 3′UTR WT）和GTPBP2 突变型（GTPBP2 3′UTR MUT）载体。按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书步骤与miR-NC 或miR-502-3p 共转染至CD133+CD44+细胞中，6 h后更换细胞培养液，继续培养48 h，按照荧光素酶试剂盒说明书步骤检测转染细胞的荧光素酶活性。

1.9 统计学处理

以上主要实验均重复3次。采用SPSS 22.0统计学软件分析实验数据，符合正态分布的计量数据以表示，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，以P<0.05 或P<0.01 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-502-3p在CCSC中低表达

利用免疫磁珠分选技术，成功从结直肠癌HCT116细胞中获得CD133-CD44-和CD133+CD44+细胞，CD133+CD44+细胞阳性率为94.35%。qPCR 法检测结果显示，CD133+CD44+细胞中miR-502-3p表达水平显著低于CD133-CD44-细胞（0.36±0.05vs0.99±0.09，t=18.357，P<0.01），因此，后续实验选择CD133+CD44+细胞。

2.2 转染miR-502-3p对CCSC增殖、周期、凋亡及相关蛋白表达的影响

转染miR-502-3p 后，qPCR 法检测结果显示，miR-502-3p 组CD133+CD44+细胞中miR-502-3p 表达水平显著高于miR-NC 组细胞（2.87±0.30vs1.00±0.07，t=18.211，P<0.01），表明成功建立miR-502-3p过表达细胞，可以进行后续实验。

MTT 法、流式细胞术和WB 法检测结果（表1、图1）显示，与miR-NC 组比较，miR-502-3p 组细胞增殖率、S 期细胞比例均显著降低（均P<0.01），Ki67、CDK1 蛋白表达显著降低（均P<0.01）；细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例均显著升高（均P<0.01），Bcl2蛋白表达显著降低（P<0.01），BAX 蛋白表达显著升高（P<0.01）。结果表明，上调miR-502-3p 可显著抑制CCSC增殖、周期进展并诱导细胞凋亡。

表1 上调miR-502-3p对CCSC增殖、周期和凋亡的影响

图1 上调miR-502-3p对CCSC细胞周期及Ki67、CDK1、Bcl2和BAX蛋白表达的影响

2.3 miR-502-3p靶向负调控GTPBP2表达

TargetScan软件预测结果显示，miR-502-3p 和GTPBP2 mRNA之间存在互补结合位点（图2A）。双荧光素酶实验报告基因实验结果显示，与miR-NC组相比，miR-502-3p 与GTPBP2 3′UTR WT 载体共转染细胞的荧光素酶活性显著降低（0.41±0.06vs0.99±0.07，t=18.873，P<0.01），而与GTPBP2 3′UTR MUT载体共转染细胞的荧光素酶活性无显著改变（1.01±0.05vs0.98±0.06，t=1.152，P>0.05）。qPCR 和WB 实验检测结果（图2B、C）显示，与miR-NC 组比较，miR-502-3p 组细胞中GTPBP2 mRNA 和蛋白表达水平均显著降低（t=25.378、17.819，均P<0.01）；与si-miR-NC 组比较，si-miR-502-3p 组细胞中GTPBP2 mRNA 和蛋白表达水平均显著升高（t=29.601、12.348，均P<0.01）。结果表明，miR-502-3p靶向负调控GTPBP2表达。

图2 miR-502-3p靶向负调控GTPBP2的表达

2.4 过表达GTPBP2可逆转上调miR-502-3p对CCSC增殖、周期和凋亡的作用

转染GTPBP2 后，qPCR、MTT、WB 和流式细胞术实验结果（图3、表2）显示，与miR-502-3p+vector组比较，miR-502-3p+GTPBP2组细胞中GTPBP2 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高（均P<0.01），细胞增殖率、S 期细胞比例均显著升高（均P<0.01），细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例均显著降低（均P<0.01），细胞中Ki67、CDK1、Bcl2蛋白表达均显著升高（均P<0.01）、BAX 蛋白表达显著降低（P<0.01）。实验结果表明，过表达GTPBP2 可逆转上调miR-502-3p 对CCSC 增殖、细胞周期和凋亡的作用。

表2 过表达GTPBP2可逆转上调miR-502-3p对CCSC增殖、周期和凋亡的影响

图3 过表达GTPBP2可逆转上调miR-502-3p对CCSC的作用

3 讨论

肿瘤干细胞是一群独特的细胞亚群，因其具有高度致瘤性而参与肿瘤的发展，对肿瘤细胞分化、增殖、转移等有重要的作用[10-12]。有研究结果[13]显示，miRNA 与CCSC 发展有关，如miR-451a 在结直肠癌细胞中表达水平较低，过表达miR-451a降低了CCSC中Ki-67、cyclin D1的表达，抑制CCSC增殖。VILLANOVA 等[14]通过对CCSC 的功能研究发现，miR-1285 通过靶向调控细胞凋亡相关蛋白酶2 表达抑制细胞增殖和阻滞周期，诱导细胞凋亡。阎立昆等[15]研究发现，miR-1231 在CCSC 中表达水平降低，过表达miR-1231抑制结直肠癌细胞增殖、迁移，并促进细胞凋亡。关于miR-502-3p的研究主要集中在胃癌，如miR-502-3p 在胃癌细胞中低表达，过表达miR-502-3p 能抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡[16]，但是对CCSC的作用尚不清楚。本研究利用免疫磁珠分选技术，从结直肠癌HCT116细胞中分选出双阴性细胞（CD133-CD44-）和双阳性细胞（CD133+CD44+），qPCR法检测结果发现，miR-502-3p在CD133+CD44+细胞中表达水平显著低于CD133-CD44-细胞，说明miR-502-3p 与CCSC发展有关。将miR-502-3p 过表达质粒转染CD133+CD44+细胞后，结果发现细胞增殖率、S期细胞比例显著降低，细胞凋亡率、G0/G1 期细胞比例显著升高，细胞中Ki67、CDK1、Bcl2 蛋白表达下调、BAX 蛋白表达上调，说明上调miR-502-3p 抑制CCSC 增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，这与上述研究结果相似。

GTPBP2 是GTPase 家族四个家族成员之一，其存在于所有真核细胞中，位于人类染色体6p21-12区域，与蛋白合成、细胞信号转导、骨架调节等密切相关，在人体卵巢、脑、胰腺、骨骼肌等组织中均有表达[10,17-18]。关于GTPBP2与肿瘤的研究相对较少，主要在人类遗传学中研究较多[19]。最近的研究结果[20]显示，GTPBP2 在非小细胞肺癌组织和细胞中表达上调，其高表达与患者TNM分期和淋巴结转移相关；敲低GTPBP2抑制非小细胞癌肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。但是GTPBP2 在结直肠癌中的作用尚不清楚。本研究通过在线数据库预测发现，GTPBP2是miR-502-3p 靶基因，通过双荧光素报告基因实验和qPCR实验验证二者的关系，结果发现miR-502-3p调控GTPBP2 的表达。上调miR-502-3p 降低CCSC中GTPBP2 mRNA和蛋白表达水平，下调miR-502-3p则上调GTPBP2 mRNA 和蛋白表达水平，结果表明miR-502-3p 靶向负调控GTPBP2 的表达。进一步实验的结果显示，过表达GTPBP2 可以部分逆转上调miR-502-3p对CCSC增殖、细胞周期和凋亡的作用。

综上所述，miR-502-3p 在CCSC 中表达下调，miR-502-3p 靶向负调控GTPBP2 的表达，从而抑制CCSC 的增殖和阻滞细胞周期并促进细胞凋亡。关于GTPBP2对CCSC作用的具体机制有待深入研究。