清肝利水方调控TRPC6/Ca2+通路抑制慢性青光眼RGC 凋亡的研究

陈梦婷，董志国，张殷建，田源

青光眼是一种致盲性眼病，以特征性视神经萎缩以及视野缺失为主要特征，病理性眼压增高是其主要危险因素[1]。2020 年全球范围内青光眼患者预估有7，600 万[2]，到2040 年可能会达到1.118 亿，对于青光眼筛查和治疗不可懈怠[3]。青光眼会引起不可逆性的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGC）损伤，如何抑制RGC 凋亡，保护视神经成为治疗青光眼的关键。中医药在慢性青光眼的治疗中有一定优势，受到越来越多的重视。清肝利水方（QGLS）是上海市名老中医、眼科专家邹菊生治疗青光眼的临床经验方，应用多年，取得了良好的效果。课题组前期基础研究[4-5]也证实了其有抑制RGC 细胞凋亡的作用，本研究拟进一步探究其保护RGC 的具体机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验选用6～8 周龄清洁级健康雄性SD 大鼠20 只，体重（150±30）g，上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于复旦大学动物实验中心，温度维持在21℃左右，12 h 光/暗循环照明，常规饲料饲养，给予充足的水和活动空间。相关实验操作均符合动物伦理及动物中心相关管理办法。

1.2 主要仪器、试剂与药物

旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，RE-2000A），OPMI VISU 显微镜（德国Carl Zeiss Jena 公司，OPMI Lumera300），高速离心机（德国Eppendorf 公司，Centrifuge 5810R），酶标仪（美国Biotek 公司，SynergyH4）、电泳仪（美国BIO-RAD 公司，PowerPacBasic Power Supply 164-5050）、小型电泳槽（美国BIO-RAD 公司，Mini-PROTEAN Tetra Cell 1658001）、转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS-8）、凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司，Chemiscope 6300）、电子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，ME104）、流式细胞仪（美国BD 公司，FACS Verse）。

RGC-5 细胞（中国科学院细胞库），水合氯醛、乌拉坦、甲醇、无水乙醇（国药集团工业股份有限公司，30037527、H37022259、67561、64175），B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（杭州华安生物技术有限公司，ET1702-53），瞬时受体电位阳离子通道6（transient receptor potential channel 6，TRPC6）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）、β-actin、二抗（美国CST公司，16716、14220、14796、4970、7074），PAGE 凝胶试剂盒、蛋白Marker、化学发光液（上海雅酶生物科技有限公司，PG112、WJ102、Omni-ECT SQ202）。

QGLS 水煎剂：QGLS 由夏枯草12 g、葛根15 g、车前子15 g、枸杞子12 g 组成。生药购于上海中医药大学附属龙华医院中药房，由上海华宇药材有限公司提供，加入7 倍生药重量体积水沸腾煎煮2 次后浓缩至1 倍体积生药重量，无菌阴干制备成药物浸膏，使用前加入适量体积水溶解成需要浓度。

1.3 缺氧缺糖-复氧复糖损伤模型的建立

配制终浓度为100 mM 的CoCl2溶液（使用时加入无糖DMEM 稀释），RGC-5 细胞以1×104个/孔铺于96 孔板中，每孔100 μL，分为6 组，每组6 个复孔，培养箱中培养24 h 后无血清的DMEM 继续培养24h。正常对照组加入正常无血清DMEM，其余5 组分别加入CoCl2浓度为100、200、400、600、800 μM的无糖DMEM，培养箱中培养0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h 后更换培养液为无血清的培养液复氧复糖24 h，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，1 h 后于酶标仪450 nm 波长测其OD 值，筛选出最佳的造模时间及浓度。结果进行至少3 次重复实验。

1.4 细胞毒性试验

制备QGLS 含药血清：将20 只SD 大鼠（150±30）g 称重，分为正常对照组（CG）、清肝利水方低、中、高浓度组（LQGLS、MQGLS、HQGLS），每组5 只。CG 大鼠灌胃饮用水2 mL/d，其余各组每日灌胃1 次低、中、高浓度QGLS（为3.1、6.2、12.4 g/kg，按人与动物之间体表面积关系换算得出该水煎剂的正常给药量为6.2 g/kg，低、高浓度组给药量为正常给药量的1/2 倍和2 倍），各组灌胃体积相同。连续灌胃4 d，于末次灌胃1.5～2 h 后进行腹主动脉取血。取血后将血液室温静置15min 后，3000rpm 离心10min 得到上清液，将上清液置于56℃水浴灭菌30 min，0.22 μM 过滤网过滤分装，最后-20℃冰箱保存。

细胞毒性实验：RGC-5 细胞以1×104个/孔铺于96 孔板，每孔100 μL，每组6 个复孔，培养24 h 后换液为无血清的DMEM 继续培养24 h，再将各组含药血清均以3%、5%、10%、20%的浓度分别干预细胞，CG 加入无血清DMEM，培养24 h 后每孔加入10 μL CCK-8 试剂，1 h 后于酶标仪450 nm 波长测其OD 值。3 次重复实验结果后，取各组均无细胞毒性的含药浓度作为干预浓度。

1.5 QGLS 药效实验

RGC-5 细胞以1×104个/孔铺于96 孔板，分为CG、模型组（MG）、LQGLS、MQGLS、HQGLS 组，每组6 个复孔。培养24 h 后换为无血清培养基再培养24 h，CG、MG 加入含大鼠空白血清的DMEM，各中药浓度组加QGLS 含药血清DMEM，各组均培养24 h，MG 及各中药浓度组换液为已筛选好浓度的含CoCl2的无糖DMEM 造模，CG 换液为无血清DMEM，适当时间后，弃造模液，各组均加入无血清DMEM 复氧复糖24 h。最后每孔加入10 μL CCK-8试剂1 h 后，于酶标仪450 nm 波长下测其OD 值。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

RGC-5 细胞以2×105个/孔铺于6 孔板中，每孔2 mL，分 为CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS，每 组做3 个复孔。干预造模等全部操作完成后，弃培养液，PBS 冲洗后收集细胞于Falcon 流式管，1，200 rpm离心5 min，弃上清，加入200 μL 的Binding buffer重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-APC 避光孵育15 min。再1，500 rpm 离心3 min，弃上清，吸取100 μL的Binding buffer 重悬细胞并加入5 μL PI 染液染色5 min，将Binding buffer 补足至300 μL，上流式细胞仪检测。

1.7 Western Blot 检测

RGC-5 细胞以2×105个/孔铺于6 孔板中，每孔2 mL，分为CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 组，每组做3 个孔，中药干预造模后，弃上清液，收集各组细胞，提取不同干预组细胞总蛋白，蛋白浓度测定后，经凝胶电泳，转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h 后加一抗（β-actin、TRPC6、Caspase-3、Bax，兔抗鼠单克隆抗体）4℃暗盒过夜，TBST 洗膜后加入相应的二抗（抗兔IgG、HRP 抗体）37℃孵育1 h，TBST 洗膜，采用ECL 荧光底物进行化学发光、显色，于凝胶成像仪拍照，以Image J 进行灰度分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白表达量/同一样本内参表达量。

1.8 Fluo-3 AM 荧光探针Ca2+检测

RGC-5 细胞以2×105个/孔铺于6 孔板中，每孔2 mL，分为CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 组，每组做3 个复孔，所有给药干预后弃培养液，PBS 冲洗，胰酶消化后加入无血清DMEM 1，300 rpm 离心3 min，弃上清加入含终浓度为4 μM Fluo-3 AM 的无血清DMEM 溶液，和细胞一起置于37℃避光孵育30 min后进行荧光探针装载，离心后PBS 洗涤，加入PBS重悬细胞并再适当孵育20～30 min，使用Fluo-3 AM荧光探针对细胞内Ca2+进行荧光标记，运用流式细胞仪进行Ca2+检测，激发波长为488 nm，以荧光强度表示细胞内Ca2+浓度。

1.9 统计学分析

采用SPSS21.0 统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析（ANOVA）进行多组变量间的比较，两两比较采用LSD-t 检验，当P＜0.05 时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QGLS 对RGC-5 细胞存活率的影响

建立缺氧缺糖-复氧复糖细胞损伤模型，筛选出各组QGLS 含药血清浓度无细胞毒性的浓度范围为0%～5%，因此选取最高5%浓度作为各组干预浓度（表1）。缺氧缺糖再复氧复糖后，发现12 h 后各浓度细胞存活率明显下降，且与CoCl2的浓度呈负相关（图1A、1B、1C）。缺氧缺糖处理24 h，600 μM CoCl2细胞存活率为（62.5±2.3）%，选取此时间及造模浓度。各组QGLS 干预后，MG 细胞存活率为（63.9±3.5）%，LQGLS、MQGLS、HQGLS 存活率分别为（93.3±2.1）%、（79.2±3.0）%、（44.5±2.6）%，较CG 均降低，差异有统计学意义（tMG=31.286，tLQGLS=8.611，tMQGLS=20.774，tLQGLS=61.477，均P=0.000）；LQGLS、MQGLS 较MG 存活率显著上升，差异有统计学意义（tLQGLS=25.401，tMQGLS=11.805，均P=0.000）（图1D）。

图1 细胞存活率。1A、1B、1C 分别表示分别处理12、24、48 h 再进行复氧复糖24 h 后的各时间点各浓度细胞存活率；1D 表示加入5%低、中、高浓度QGLS 含药血清预处理24 h 后再进行缺氧缺糖-复氧复糖造模后的细胞存活率，缺氧缺糖时间为24 h

表1 各组含药血清细胞存活率（，%）

表1 各组含药血清细胞存活率（，%）

注：* 与本组含药血清浓度0%比较，P＜0.05；CG 正常对照组；LQGLS、MQGLS、HQGLS 分别为清肝利水方低、中、高浓度组

2.2 QGLS 对RGC-5 细胞凋亡率的影响

本实验中使用Annexin V-APC／PI 复染法检测细胞凋亡（图2）。CG 细胞凋亡率为（6.13±1.11）%，MG 细胞凋亡率为（41.73±3.15）%，其他各组细胞凋亡率分别为LQGLS（18.34±1.86）%、MQGLS（18.32±1.92）%、HQGLS（36.94±2.63）%，各实验组较CG 细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（tMG=15.035，tLQGLS=7.961，tMQGLS=7.752，tHQGLS=15.214，均P=0.000），LQGLS、MQGLS 较MG 降低，差异均有统计学意义（tLQGLS=9.020，tMQGLS=8.953，均P=0.000），HQGLS 组与MG 组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 细胞凋亡情况。2A、2B、2C、2D、2E 分别表示CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 细胞凋亡的情况。十字象限左上表示坏死细胞，左下表示正常细胞，右上表示晚期凋亡细胞，右下表示早期凋亡细胞。2F 表示各组细胞凋亡率。

2.3 QGLS 对TRPC6、Bcl-2、Bax、Caspase-3 的影响

细胞缺氧缺糖-复氧复糖损伤后，TRPC6 表达MG、LQGLS、MQGLS 较CG 升高（tMG=13.331，P=0.000；tLQGLS=5.756，P=0.000；tMQGLS=5.385，P=0.001），而MQGLS、HQGLS 较MG 降低（tMQGLS=7.365，tHQGLS=9.075，均P=0.000），LQGLS 较MG 差异无统计学意义（P＞0.05）；Caspase-3 表达MG 较CG 显著升高（tMG=39.004，P=0.000），LQGLS、MQGLS、HQGLS 较MG 均显著下降（tLQGLS=4.816，P=0.001；tMQGLS=35.131，P=0.000；tHQGLS=28.227，P=0.000）；Bax 表达MG 较CG显著升高（tMG=17.374，P=0.000），LQGLS、MQGLS、HQGLS 较MG 均显著下降（tLQGLS=14.912，tMQGLS=10.194，tHQGLS=12.838，均P=0.000）；Bcl-2 表达MG、LQGLS 较CG 显著下降（tMG=9.466，tLQGLS=6.135，均P=0.000），LQGLS、MQGLS、HQGLS 较MG 均升高（tLQGLS=8.871，tMQGLS=12.729，tHQGLS=9.298，均P=0.000）（图3、表2）。

图3 各组TRPC6、Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相对表达水平

表2 各组TRPC6、Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相对表达水平（，n=5）

表2 各组TRPC6、Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相对表达水平（，n=5）

注：* 与CG 比较，P＜0.05；# 与MG 比较，P＜0.05；CG 正常对照组；MG 模型组；LQGLS、MQGLS、HQGLS 分别为清肝利水方低、中、高浓度组；Bcl-2 B 细胞淋巴瘤-2；TRPC6 瞬时受体电位阳离子通道6；Caspase-3 半胱氨酸蛋白酶-3；Bax Bcl-2 相关X 蛋白

2.4 QGLS 对细胞内Ca2+的影响

使用FACS 软件分析结果，CG、MG 细胞内Ca2+荧光强度分别为：（5.33±0.74）和（41.51±3.59），LQGLS、MQGLS、HQGLS 细胞内Ca2+荧光强度分别为：（16.71±2.63）、（21.52±2.80）、（36.21±2.33），MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 细胞内Ca2+荧光强度较CG均升高，差异均有统计学意义（tMG=13.960，P=0.000；tLQGLS=5.889，P=0.001；tMQGLS=7.877，P=0.000；tHQGLS=17.815，P=0.000）。LQGLS、MQGLS 较MG细胞内Ca2+浓度显著下降，差异均有统计学意义（tLQGLS=7.881，tMQGLS=6.204，均P=0.000），HQGLS 较MG 差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

目前，临床上治疗青光眼的方法仍以降眼压为主，降眼压可以有效控制一部分青光眼患者视野缺失，减缓视神经萎缩以及缓解眼部不适症状，但降眼压药水带来的诸如眼干涩、结膜充血等副作用明显，并且部分患者在降眼压治疗处理后仍无法阻止视野及视盘损害[6-7]。邹菊生[8]认为本病病位在肝，病机是情志不畅致肝失疏泄，日久肝郁气滞而化火，肝火上扰于目，致使目中脉络阻滞，玄府郁闭，神水滞留，运行不畅，而导致眼胀视物膜糊，久则损害目系，故创立清肝利水方（QGLS）。该方以夏枯草、葛根清肝泻火为君，车前子利水为臣，佐以枸杞子补肝肾明目，共筑清肝利水明目之效。课题组在前期临床研究[8]中发现，较单纯使用降眼压滴眼液，肝郁气滞型原发性开角型青光眼患者采用QGLS 联合降眼压滴眼液总有效率升高，且在视力、视力平均敏感度及全身症状均改善明显。

细胞凋亡通过激活Caspase 来介导，细胞凋亡的效应器Caspase 与一些底物反应，导致凋亡细胞发生特有的生化和形态学改变，形成凋亡复合体被吞噬细胞吞噬[9-10]。Bcl-2 家族蛋白是细胞凋亡的关键调节因子，主要作用于线粒体外膜[11]，它会促进细胞存活而不促进细胞增殖[12-14]。Semaan 等[15]发现敲除Bax 基因的小鼠对神经损伤后的视网膜神经节细胞凋亡通路有永久性阻断作用。本实验中，模型组RGC-5 细胞中Caspase-3、Bax 表达水平较对照组明显上升，并且Bcl-2 表达水平下降，表明造模后，由于细胞缺血缺氧，RGC 凋亡明显，而中药组Caspase-3、Bax 表达水平较模型组明显下降，Bcl-2表达上升，说明QGLS 抗RGC 凋亡的机制与提高Bcl-2 的表达和降低Bax 的表达有关。

RGC 是一种神经元，位于RGC 层，可以从光感受器接收视觉信息，并以产生动作电位的形式传递视觉信息使其形成在视网膜上[16]，视网膜病变引起的神经元结构变化以RGC 的变化最为显著[17-18]，目前明确认为RGC 的凋亡是渐进而不可逆的[19-21]。

TRPC6 属于TRPC 基因家族[22-24]，是一种通透膜通道蛋白，是Ca2+渗透性的非选择性阳离子通道[25-26]，参与神经元存活与凋亡[27]，其分布在视网膜上的具体位置主要位于RGC[28-29]，对RGC 在缺血前具有早期神经保护作用[30]。本次实验中，Western Blot 结果显示模型组的RGC-5 细胞中TRPC6 蛋白表达较对照组显著上升，表明造模后RGC 损伤严重，TRPC6应激性升高，而QGLS 低、中、高剂量组较模型组的TRPC6 蛋白表达水平明显下降，已知TRPC6 对RGC 具有保护作用，QGLS 各剂量组均降低了此蛋白表达，可能由于QGLS 保护了RGC，延缓了TPRC6 信号通道的激活。

Ca2+作为细胞内的第二信使，参与转录因子的激活、细胞增殖与凋亡、蛋白质的修饰等细胞内生理活动[31]。细胞内外Ca2+浓度梯度差异是其信号传导的前提和重要条件[32]，Ca2+内流导致细胞内Ca2+超载会最终导致RGC-5 细胞的凋亡[33]。本次实验，模型组细胞内Ca2+明显增加而导致细胞损伤，用药后，QGLS 中、高剂量组细胞内Ca2+浓度下降，表示QGLS 抑制了Ca2+内流并提高线粒体膜电位，降低线粒体促凋亡信号因子Caspase-3 的表达，抑制RGC-5 细胞的凋亡。

虽然中药复方的成分复杂多样，而且作用机制和靶点不一，但通过此实验，初步发现QGLS 抑制慢性青光眼RCG 凋亡，保护视神经的作用机制可能是通过降低TRPC6 的表达以减少Ca2+内流来实现的，并且在RGC-5 缺氧缺糖-复氧复糖细胞损伤模型中也有一定的保护作用。未来需要进行更深入的研究以明确QGLS 对视神经细胞的保护作用。