法夫酵母耐热基因工程菌的构建

杨 蒙 蒙， 刘 诗 文， 刘 冰 南

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

虾青素(astaxanthin)作为叶黄素家族中的一种，是类胡萝卜素的氧化衍生物。虾青素属于萜烯类不饱和化合物，具备极强的抗氧化能力，可有效提高机体的免疫力，在心血管疾病、肿瘤和某些免疫系统类疾病的治疗与预防方面具有巨大的潜能[1]。与化学合成的虾青素相比，天然来源的虾青素具有更好的活性。法夫酵母作为虾青素的一种天然来源，其发酵条件简单，易于实现高密度培养。但法夫酵母最适细胞生长和色素合成的温度在20 ℃左右，发酵中后期需消耗大量能源降温，导致生产成本增加，难于工业化生产。目前报道的提高法夫酵母生产虾青素温度的方法主要是原生质体融合和化学诱变。通过原生质体融合的方式获得的耐热菌株，虾青素产量与出发菌株相比显著降低[2]，甚至不能生产虾青素[3]。通过将外源基因整合到法夫酵母基因组以提高虾青素生产温度的方法未见报道。

本实验将外源热激蛋白编码基因整合到法夫酵母基因组上，构建耐热基因工程菌株，以期提高法夫酵母耐热性，降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌株：E.coliTop10；法夫酵母XanthophyllomycesdendrorhousCBS6938；嗜热菌ThermusthermophilesHB8 CGMCC1.6492。

所用引物如表1所示。

1.2 方 法

1.2.1 法夫酵母质粒的构建

1.2.1.1 质粒pUC18-18S的构建

根据法夫酵母18S rDNA基因序列(GenBank：D 31656.1)，以SalⅠ作为酶切位点设计引物18S-F和18S-R，以法夫酵母基因组DNA作为模板，使用高保真酶Dpx(Tolobio)进行18S rDNA片段PCR扩增。18S rDNA片段与去磷酸化的pUC18质粒线性化载体用T4连接酶(Takara)在16 ℃连接30 min，构建质粒pUC18-18S。构建好的质粒转化到大肠杆菌中扩增，用质粒小提试剂盒(上海生工)提取质粒。以M13F-47和M13R-47为引物进行菌落PCR，验证质粒pUC18-18S是否构建成功。

表1 实验所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.2.1.2 质粒pUC18-kan-18S的构建

在pUC18-18S质粒中添加G418抗性基因kan(816 bp，GenBank：KY 860085.1)作为标记，以质粒pET-28为模板，以kan-F0和kan-R0为引物，使用高保真酶进行kan基因PCR扩增。根据法夫酵母基因组中肌动蛋白基因(GenBank：X 89898.1)启动子(pact，580 bp)和终止子(tact，552 bp)的序列，以SalⅠ作为酶切位点来设计启动子引物Pact-F、Pact-R1和终止子引物Tact-F1、Tact-R1，以法夫酵母基因组DNA作为模板，使用高保真酶进行启动子和终止子片段PCR扩增[4]。将tact-kan-pact通过融合PCR进行连接，连接后的片段与pUC18-18S质粒分别用SalⅠ酶切，用T4连接酶进行连接，产物转化大肠杆菌扩增并提取质粒。以M13F-47，kan-F0，Tact-F1为引物进行质粒测序，验证质粒pUC18-kan-18S是否构建成功。

1.2.2 法夫酵母热激蛋白元器件的构建

提取纯化质粒pUC18-kan-18S，利用HindⅢ37 ℃酶切1 h。以T.thermophilesHB8基因组为模板，以groes-F和groes-R为引物，采用高保真聚合酶进行PCR扩增，得到306 bp的PCR产物groes(Gene ID：3168828)。以法夫酵母基因组为模板，分别以Pact-groes-F、Pact-groes-R和Tact-groes-F、Tact-groes-R为引物扩增得到片段pact和tact。将pact-groes-tact采用融合PCR方法连接，经Hind Ⅲ酶切后，连接到酶切后的pUC18-kan-18S质粒上，进行测序，命名为pUC18-kan-18S-groes。

1.2.3 法夫酵母感受态细胞的电击转化

感受态细胞制备和电击转化参考文献[5]的方法，采用Eppendorf Eporator电转化仪，具体电击条件：电转仪电压500 V，时间5 ms。电击后菌液涂布于含有50 μg/mL G418的PDA抗性平板上，进行阳性克隆筛选。

1.2.4 法夫酵母XD-G外源基因表达鉴定

2% XD-G种子液接种于PD液体培养基中(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L)，25 ℃振荡培养，转速180 r/min，每12 h取样一次，离心去上清，菌体液氮速冻，置于-80 ℃冰箱中保存，进行RNA提取。将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，groes-F1和groes-R1为引物进行PCR。

1.2.5 法夫酵母XD-G发酵动力学曲线测定

取9个250 mL摇瓶，装液量50 mL，接种量2%，培养温度25 ℃，转速180 r/min，培养120 h，每次随机抽取3瓶取样，HPLC法测定虾青素含量[6]、葡萄糖消耗以及细胞OD600。

2 结果与讨论

2.1 法夫酵母表达质粒的构建

将法夫酵母18S rDNA基因插入pUC18上作为同源片段，构建pUC18-18S质粒。将法夫酵母肌动蛋白启动子pact-G418抗性基因kan-肌动蛋白终止子tact融合成一个片段，构建可在法夫酵母中表达的G418抗性基因盒。将基因盒连接到pUC18-18S上构建质粒pUC18-kan-18S。经测序，证明质粒pUC18-kan-18S构建成功。

2.2 法夫酵母热激蛋白元器件的构建

嗜热栖热菌能够在75 ℃条件下生长，是由于其细胞内含有丰富的热激蛋白[7]。在高温环境下，热激蛋白能够帮助热变性的蛋白质恢复原有的空间构象和功能，从而帮助细胞抵御热胁迫[8]。基因groes编码的热激蛋白10(HSP10)通常作为一种辅助蛋白，常与热激蛋白HSP60(groes基因)形成圆柱形结构，能够特异性的识别由于高温导致变性的蛋白质，使其进入中空部分，帮助受损蛋白质重新正确折叠后，释放出修复后的蛋白质[9]。

采用融合PCR技术，将启动子pact、热激蛋白基因groes和终止子pact连为一条基因片段，目的基因P-groes-T(1 512 bp)融合结果如图1所示。

按构建pUC18-kan-18S的方法，将目的基因P-groes-T连接到质粒pUC18-kan-18S，构建法夫酵母热激蛋白元器件，命名为pUC18-kan-18S-groes，质粒示意图如图2所示。将质粒导入大肠杆菌感受态细胞中，利用Amp LB平板进行阳性克隆筛选。以groes-F和groes-R为引物，通过菌落PCR筛选阳性克隆菌株，结果如图3所示。

M，DNA marker；1，目的基因groes图3 质粒pUC18-kan-18S-groes的PCR结果Fig.3 PCR result of positive clones for plasmidpUC18-kan-18S-groes

2.3 耐热工程菌株的构建

2.3.1 法夫酵母XD-G阳性克隆菌株的筛选

挑取抗性平板上生长的法夫酵母菌落进行裂解，以裂解液为DNA模板，以groes-F和groes-R为引物进行PCR，结果如图4所示。有3株菌落出现目的基因groes条带。产物测序，并与groes基因序列比对，验证该PCR产物为groes基因。结果表明，groes基因已成功整合到法夫酵母基因组上，命名为法夫酵母XD-G。

M，DNA marker；1，2，3，目的基因groes图4 法夫酵母XD-G的PCR验证Fig.4 PCR result of X. dendrorhous XD-G

将法夫酵母XD-G分别置于25、28、30 ℃，180 r/min振荡培养4 d，测定不同培养条件下XD-G的虾青素质量分数。结果表明，XD-G在25 ℃能够生长并合成虾青素，虾青素质量分数为177.7 μg/g，表明XD-G与野生型法夫酵母相比，培养温度提高了5 ℃。因此，将目的基因groes整合到法夫酵母基因组上，能够保护法夫酵母合成虾青素的相关酶，使其在25 ℃条件下仍具有活性。但是当培养温度升高到28～30 ℃，XD-G生物量显著降低且无虾青素生成。

2.3.2 法夫酵母XD-G外源基因表达鉴定

如图5所示，经鉴定groes在法夫酵母mRNA水平上有表达，目的基因产物大小为119 bp。PCR产物纯化后测序，序列经过比对证明为groes目的基因。结果表明，法夫酵母XD-G在25 ℃培养条件下，外源基因groes在法夫酵母mRNA水平上有表达，但表达量偏低。groes编码的HSP 10 是典型的热激蛋白，通常情况HSP 10作为协助伴侣分子与groes编码的HSP 60热激蛋白形成筒状结构，协助非天然构象的蛋白质和新生肽链进行正确折叠，对提高细胞耐热性发挥着重要作用[10]。有学者对酿酒酵母耐热元器件进行筛选，发现虽然热激蛋白基因groes在mRNA上的表达量相较于其他热激蛋白基因表达量较低，但是插入热激蛋白基因groes获得的酿酒酵母工程菌S.c-GroES耐热性最好[7]。本实验获得的法夫酵母耐热工程菌株法夫酵母XD-G中热激蛋白基因groes在mRNA上表达量较低，但能够有效地将法夫酵母最适培养温度提高5 ℃，与这一结果相一致。

M，DNA marker；1～5分别为培养12，24，48，72，96 h的目的基因groes图5 法夫酵母XD-G中groes基因在mRNA水平上的表达验证Fig.5 Expression of the groes gene in X.dendrorhousXD-G at mRNA level

2.4 法夫酵母XD-G发酵动力学曲线

如图6所示，法夫酵母XD-G于84 h时OD600达到最大值，进入菌体发酵的稳定期，此时葡萄糖完全消耗，虾青素合成达到最大值177.7 μg/g。法夫酵母野生型菌株在25 ℃条件下生物量极低且无虾青素生成，说明法夫酵母发酵受温度影响明显。在20 ℃的条件下，发酵96 h后虾青素产量为140.3 μg/g[11]。与野生型法夫酵母相比，基因工程菌株法夫酵母XD-G的培养温度提高到25 ℃，菌体的生长速度减慢，虾青素产量提高了26.7%。在发酵培养初期，法夫酵母XD-G生长缓慢，说明外源基因groes表达需要一定时间，当表达一定量的热激蛋白后，热激蛋白可保护菌体由于升温带来的损害。虾青素产量提高的原因可能是温度升高导致氧化压力提高，有研究表明氧化压力使更多的萜类化合物代谢流进入虾青素合成途径[12]。

图6 法夫酵母XD-G发酵动力学曲线Fig.6 Kinetics of X. dendrorhous XD-G

3 结 论

实验通过无缝拼接的方式构建了法夫酵母表达载体pUC18-kan-18S。从嗜热栖热菌HB8基因组中获得热激蛋白基因groes，采用融合PCR及无缝拼接的方法构建了热激蛋白元器pUC18-kan-18S-groes。将热激蛋白元器件电击转化到法夫酵母感受态细胞中，筛选出pUC18-kan-18S-groes阳性克隆菌株法夫酵母XD-G，并验证了其在RNA水平上有一定表达。升高培养温度至25 ℃，法夫酵母XD-G能够在25 ℃条件下生长并合成虾青素，发酵84 h虾青素产量达到177.7 μg/g，比20 ℃培养时虾青素产量提高了26.7%。