黄芩对妊娠晚期大鼠子宫运动节律及PGE、COX2水平的影响

周 健，曲冬颖，杨 清

随着社会进步及计划生育政策的推行，顺利分娩和保障母婴安全对实现优生优育、提高人口素质尤为重要。研究显示，难产、过期妊娠、高危妊娠等仍是给母婴安全带来严重威胁的关键因素，针对这种情况需要采取主动促分娩措施如引产、催产等。目前临床主要采用药物治疗、机械性治疗、剖宫产等方法促分娩，但均存在着或多或少的副作用。因此，寻求一种安全有效的引产、催产方法，促进分娩的发动及进行是产科面临的一个重要课题。黄芩是临床常用的一种清热燥湿传统中药，既往研究显示，黄芩可显著增加家兔离体子宫收缩频率。目前，有关黄芩对妊娠晚期大鼠子宫运动节律的影响研究尚未见报道。本研究探讨黄芩对妊娠晚期大鼠子宫运动节律的影响，以期寻求安全有效的引产、催产方法。

1 资料与方法

1.1 动物来源及分组 150只健康成年无特定病原体动物(specified pathogen free，SPF)级大鼠(8周龄)，体质量180～240 g，平均体质量(210±24)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证为[SCXK(京)2016-0008]。

1.2 主要试剂与仪器 黄芩提取物(购自西安飞达生物技术有限公司)；BCA试剂盒、蛋白提取试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司；前列腺素E(Prostaglandin E，PGE)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)引物序列由大连宝生生物工程有限公司设计并合成；PGE、COX-2、β-actin抗体、山羊抗兔HRP二抗均购自北京索莱宝科技有限公司。OptimaXPN超速离心机，购自贝克曼库尔特生物科技有限公司；CW-3型恒温平滑肌槽(上海继德教学实验器械厂)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及处理 100只健康成年SPF级雌性大鼠、50只雄性大鼠适应性饲养7 d后，按照2∶1雌雄合笼交配，次日用无菌棉签给雌鼠作阴道涂片并进行镜检发现有大量精子视为妊娠成功，为妊娠第1天，选取符合要求的40只妊娠大鼠随机分为4组，即对照组及黄芩提取物低、中、高剂量组(后期命名为黄芩低、中、高剂量组)，每组10只。

黄芩低、中、高剂量组大鼠分别于大鼠妊娠第19天时给予成人临床等效剂量(6 g/60 kg)的4倍、8倍、16倍(400、800、1600 mg/kg)单次灌胃处理；对照组于同时间给予等量生理盐水灌胃处理，同日观察大鼠胎鼠娩出情况。

1.3.2 子宫肌条标本采集将妊娠第20天的各组大鼠麻醉后剖宫取胎并立即统计仔鼠总数及活胎数，后充分暴露Y形子宫，沿子宫颈部纵向剖开一侧，剥离宫内胎鼠及周边脂肪组织后，将子宫铺平，均等切取该侧子宫肌条，两侧子宫切取肌条方法相同，每只大鼠子宫取9个肌条，分为三部分，一部分做子宫肌条张力测定，做好标记后立即置于37 ℃台式液中；另两部置于液氮中保存，分别用于PGE、COX2 mRNA及其蛋白检测。

1.3.3 肌张力测定 取1.3.2中各组大鼠部分子宫肌条，每个肌条两端均用0-0手术线缝合打结，设置恒温平滑肌槽温度调整为37 ℃，槽内加入足量台式液，将打结好的子宫肌条分别放入槽内，顶端、底端打结处与张力传感器两端连接，调节张力传感器至2 g左右重量，依次对所有肌条分别进行肌张力测定，并做好记录，其中子宫活动力=宫缩强度×宫缩频率。

1.3.4 实时荧光定量PCR法检测各组大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2 mRNA水平 提取1.3.2各组大鼠部分子宫肌条组织中总RNA并测浓度，以RNA为模板行反转录反应，所得cDNA行qRT-PCR反应。体系20 μl：2×ULtraSYBR mixture 10.0 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，上下游引物各2.0 μl，ddHO 4.0 μl；条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40个循环。PGE、COX2以GAPDH作为内参，采用2方法计算PGE、COX2 mRNA水平相对表达量(引物序列见表1)。

表1 引物设计

1.3.5 免疫印迹法检测各组大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2蛋白表达变化 取1.3.2各组大鼠部分子宫肌条组织，剪碎制备匀浆，以RIPA液冰上裂解，孵育20 min，离心10 min(10 000 r/min，8 cm)取上清，测定蛋白总量并取20 μg与等量上样缓冲液混匀，沸水浴变性，进行电泳、转膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST清洗，之后加入PGE、COX2及内参β-actin作为一抗(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入山羊抗兔二抗(1∶5000)，37 ℃ 1.5 h，显影、定影并成像，计算各蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠终止妊娠结果比较 四组大鼠胎鼠总数、活胎鼠率无统计学差异(>0.05)；与对照组比较，黄芩低、中、高剂量组大鼠于妊娠第19天用药后娩出鼠数呈剂量依赖性增加(<0.05，表2)。

表2 各组妊娠晚期大鼠(n=10)终止妊娠结果比较 (n；%)

2.2 各组大鼠子宫肌条张力结果比较 与对照组比较，黄芩低、中、高剂量组大鼠宫缩频率、宫缩强度及子宫活动力水平均升高(<0.05)，呈剂量依赖性(表3)。

表3 各组妊娠晚期大鼠子宫肌张力结果比较

2.3 各组大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2 mRNA水平比较 与对照组比较，黄芩低、中、高剂量组大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2 mRNA水平均升高(<0.05)，呈剂量依赖性(表4)。

表4 各组妊娠晚期大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2 mRNA水平比较

2.4 各组大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2蛋白水平比较 与对照组比较，黄芩低、中、高剂量组大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2蛋白水平均升高(<0.05)，呈剂量依赖性(图1、表5)。

注：PGE.前列腺素E; COX2. 环氧合酶2;A.对照组；B.黄芩低剂量组；C.黄芩中剂量组；D.黄芩高剂量组

表5 各组妊娠晚期大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2蛋白水平比较

3 讨 论

目前，难产、过期妊娠、高危妊娠等因素仍是严重威胁母婴安全的主要因素，针对这种情况需要采取主动促分娩措施，否则会导致胎儿宫内窘迫、高胆红素血症、围生儿病死率增高、难产、产伤、母体产后大出血及刮宫率高等不良事件发生。引产是临床主要的促分娩措施，目前药物治疗、机械性治疗、剖宫产等是临床常用促分娩方法，但均有一定弊端，因此探寻新的安全可靠的促分娩方法是产科医师的研究热点。

黄芩是唇形科唇形科黄芩属植物黄芩的干燥根，具有补气升阳、固表散寒之功效，毒副作用小，价格低廉且来源丰富。《医学心悟·夫人门》有道“新孕妇人，胎气顽固，腹皮紧窄，气血裹其胞胎，最难转动”，意为元气旺则胎运转有力，能够有助于孕晚期孕妇临产时的血气流动，进而有助于分娩发动。产力包括子宫收缩力、腹壁肌和膈肌收缩力以及肛提肌收缩力，其中以子宫收缩力为主，研究显示，子宫收缩乏力是导致产程延长及产后大出血的主要原因之一，因此积极防治子宫收缩乏力，促进子宫收缩可促进分娩及避免子宫收缩乏力导致的产后大出血。

孔祥峰等发现，黄芩对家兔离体子宫收缩具有促进作用。本研究结果显示，四组大鼠胎鼠总数、活胎鼠率无显著差异，且与对照组比较，黄芩低、中、高剂量组大鼠于妊娠第19天用药后娩出鼠数呈剂量依赖性增加。说明黄芩可促使妊娠后期大鼠终止妊娠并促进胎鼠娩出，具有一定安全性。与对照组比较，黄芩低、中、高剂量组大鼠宫缩强度、宫缩频率及子宫活动力水平均升高，呈剂量依赖性。与既往相关研究结果相似，说明黄芩可能促进妊娠晚期大鼠子宫收缩，促进大鼠分娩。

COX是与内质网及细胞核膜结构相连的糖蛋白复合物，主要有两种同工酶形式，分别为COX-1、COX-2，与胚胎移植及妊娠分娩过程有关。COX主要负责诱导PG的合成及分泌，PG是脂质代谢物，在胚胎着床及维持妊娠等方面发挥着重要作用，能够调节子宫肌层收缩、子宫与胎盘间的血流循环及子宫颈成熟等。研究发现，PGE2能够收缩子宫平滑肌，促进分娩过程中子宫肌收缩效应，特别是在分娩时能增强催产素引起的收缩反应，促进分娩。贾瑞喆等发现，子宫平滑肌与蜕膜组织中PGE2浓度与缩宫素引产成功率有关，缩宫素可促进PGE2合成，PGE2又可促进缩宫素分泌，促进分娩。本研究结果显示，与对照组比较，黄芩低、中、高剂量组大鼠子宫肌条组织中PGE、COX2 mRNA及PGE、COX2蛋白水平均升高，且均呈剂量依赖性。说明黄芩能够促进妊娠晚期大鼠子宫收缩，促进大鼠分娩，可能是通过促进COX2表达，进而促进PGE2合成及分泌实现的。

综上所述，黄芩可能通过促进妊娠晚期大鼠子宫肌组织COX2及PGE2合成及分泌，促进妊娠晚期大鼠子宫收缩进而促进大鼠分娩，可为临床寻找安全可靠的促分娩方法提供一定参考。