人参皂苷Rg1对大鼠海水淹溺性肺损伤的保护作用及其机制

田 冶，葛帅娜，李 军，陶天柱

全世界每年因淹溺死亡的人数达40万以上，因海水淹溺而死亡的人数居意外死亡人数的第三位。人体吸入海水后，可迅速导致剧烈的肺部炎性反应，由此产生海水吸入性肺损伤(seawater induced acute lung injure, SW-ALI)，其病情危重，进展快，病死率高。尽管器官保护治疗技术取得不断进步，但目前临床上对SW-ALI的救治仍然缺乏有针对性的有效措施，其死亡率仍居高不下。人参皂苷Rg1是从人参中提取的一种主要有效成分，在多种炎性疾病中发挥抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡等保护作用。本研究以大鼠建立海水淹溺性肺损伤模型，通过呼吸功能、氧化应激和炎性指标的测定，探讨人参皂苷Rg1对海水淹溺性肺损伤的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 健康6周龄雄性SD大鼠，体重200～240 g(解放军总医院第六医学中心实验动物中心)。实验海水(海南三亚，东经109°，北纬18°)Na310 mmol/L，K7.1 mmol/L，Mg9.16 mmol/L，Ca9.0 mmol/L, Cl365 mmol/L，pH 8.2)Bradford试剂盒和MPO试剂盒(南京建成)，ELISA试剂盒(美国R&D)。

1.2 动物分组和动物模型制备 128只SD大鼠按照随机数字表法分为4组，每组32只：空白对照组(C组)、生理盐水对照组(S组)、低剂量人参皂苷Rg1(20 mg/kg)治疗组(L组)、高剂量人参皂苷Rg1(100 mg/kg)治疗组(H组)。吸入海水前2 h，L组和H组经尾静脉注射人参皂苷Rg1(20 mg/kg或100 mg/kg)200 μl，S组注射等容生理盐水200 μl。实验大鼠禁食水12 h，采用腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，仰卧位固定。颈前区暴露气管后切开，插入气管导管，分离股动脉插入连接三通的套管针以备取血。以4 ml/kg剂量在气管内滴注海水，4 min内完成。灌注后大鼠即刻出现呼吸困难，口唇发绀，经气管插管喷出粉红色泡沫样液体，双肺满布湿啰音，动脉血气PaO<60 mmHg提示造模成功。80只大鼠(每组20只)用于检测血气、生化及病理等指标，48只(每组12只)大鼠单独用于观察生存期。

1.3 观察指标 分别于吸入海水前(T)，吸入海水后30 min(T)、1 h(T)、2 h(T)和4 h(T)抽取股动脉血0.3 ml检测动脉氧分压(PaO)、动脉二氧化碳分压(PaCO)；肺泡灌洗液离心后取上清，蛋白测定按照Bradford试剂盒严格操作，髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)测定按照试剂盒说明操作，比色法计算结果；吸入海水后2 h和4 h每组各取5只大鼠，心脏采血处死后取出肺组织标本，用ELISA试剂盒测定血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6含量和左肺上叶肺组织匀浆MDA、SOD浓度；左肺下叶经甲醛溶液固定48 h后，石蜡包埋后切片，苏木精-伊红(HE)染色后在显微镜下检查；取右肺称重后为湿重，置于70 ℃电热恒温干燥箱中烤48 h，称重为干重，干重与湿重之比为肺干湿重比 (W/D) ；记录各组大鼠4 h的存活率。

2 结 果

2.1 海水淹溺大鼠氧合指标 与C组相比，海水淹溺大鼠在建模后30 min时PaO显著降低，PaCO显著升高，随后PaO轻度升高且PaCO有所降低。T时3组的动脉血PaO、PaCO差异均无统计学意义。T～T时S和L组PaO明显低于H组(<0.05)，S和L组PaCO明显高于H组(<0.05，表1)。

表1 海水淹溺组和对照组大鼠不同时间PaO2和PCO2的变化

2.2 肺泡灌洗液蛋白含量和肺组织湿干重比 与对照组相比，海水淹溺组大鼠的肺泡灌洗液蛋白定量(BALF)和肺组织湿干重比明显增高，2 h和4 h时，H组上述指标均明显低于S组和L组，差异有统计学意义(均<0.05，表2)。

2.3 氧化应激反应和外周血炎性因子 与对照组相比，海水淹溺组大鼠肺组织中MDA和MPO浓度显著升高，SOD活性则明显下降，血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平表达显著升高，提示肺组织内氧化应激损伤和全身的炎性反应激活。与S组相比，H组肺组织中MDA、MPO和细胞因子的表达水平均明显降低，而SOD的活性显著升高(均<0.05，表2)。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液蛋白定量、湿/干比、氧化应激和外周血炎症因子指标的比较

2.4 大鼠肺组织病理 吸入海水4 h后不同组大鼠肺组织病理切片，可见S组和L组肺间质水肿、出血，肺泡塌陷，并有大量炎性细胞浸润。H组肺组织结构尚清晰，渗出明显减少，炎性浸润也较前两组有明显减轻(图1)。

图1 各组大鼠建模4 h后的肺组织病理表现(HE，×100倍)

2.5 大鼠生存期 C组、S组、L组和H组分别死亡0、9、7、3只，死亡率依次为0、75.0%、58.3%和25.0%(=12只/组)。与S组相比，H组大鼠死亡率明显降低(<0.05)，L组与S组相比无统计学差异。

3 讨 论

海水由于高渗与碱性的特点，其所造成的肺损伤更容易出现低氧血症和酸中毒，并可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，救治难度极大。海水吸入后可以直接损伤肺泡内皮细胞，破坏肺泡毛细血管屏障，导致肺泡和肺间质渗出水肿，同时激活炎症的级联放大效应，引起局部和全身的炎性反应综合征。目前针对SW-ALI的治疗方法主要有肺泡灌洗、糖皮质激素、吸入肺泡表面活性物质和器官功能支持治疗等，但整体的救治存活率仍然较低。本研究发现，在气管内注入海水后，大鼠很快出现呼吸急促，气道内产生大量泡沫样痰，血气结果提示氧分压降低，CO分压明显升高，其原因可能是海水刺激引起气道痉挛，同时气道分泌物阻塞导致通气功能障碍，出现Ⅱ型呼吸衰竭。随着气道分泌物逐渐减少，大鼠通气功能改善，CO分压进行性降低而氧分压逐渐升高。在大鼠肺脏病理检测中观察到肺间质的水肿、肺泡塌陷、炎性细胞浸润，提示肺内可能存在通气血流比例失调和分流存在，这与血气指标中持续性的低氧血症结果一致。

人参皂苷Rg1为四环三萜类衍生物，具有抗氧化应激、抗炎症反应、抗纤维化和神经保护作用等功效。Rg1可以清除心脏、肾脏缺血再灌注损伤中产生自由基，保护内源性SOD的活性。Rg1还可通过阻断 TLR4/NF- κB/NLRP3通路减轻脂多糖诱导的新生大鼠心肌细胞和脓毒症小鼠的炎性反应和凋亡，恢复受损的心功能。笔者前期研究发现，人参皂苷Rg1可以减轻小鼠脓毒症所致的肺组织损伤，抑制机体炎性反应，减少淋巴细胞的凋亡，显著改善脓毒症小鼠的生存期。在肝缺血再灌注模型中我们发现，Rg1可以显著减少肝细胞的坏死和凋亡，抑制氧化应激反应，减轻肝脏局部和全身的炎性反应。

本实验结果显示，与对照组比较，高剂量Rg1能显著提升SOD活性，并降低肺组织内MDA浓度和MPO活性，明显改善海水吸入后 30、60、120 min的氧合功能，提示Rg1能抑制海水对肺组织的氧化应激损伤，减轻肺组织内渗出水肿，从而改善大鼠的生存期。SOD是一种重要的抗氧化酶，可与过氧化物酶和催化酶一起可消除活性氧(ROS)。MPO属于血红素蛋白，富含于中性粒细胞中，在杀灭微生物和调节炎性反应发挥作用。MDA是生物体脂质过氧化的代谢产物，也是机体氧化应激的重要标志物。本研究中模型组内大量炎性细胞浸润与MPO表达升高相吻合，提示中性粒细胞募集活化释放氧自由基参与肺损伤的发生。TNF-α、IL-1β和IL-6是重要的促炎性细胞因子，主要由巨噬细胞和中性粒细胞产生。通过Toll样受体、RIG-1受体或NOD样受体等模式识别受体，激活胞内的炎性反应信号通路，使细胞因子分泌增加。促炎性因子进一步活化肺内皮细胞、上皮细胞和白细胞，诱导肺内瀑布炎性反应的发生，因此抑制炎性因子的表达可以减轻肺组织损伤。与既往研究一致，本研究发现Rg1呈剂量依赖性抑制炎性因子的表达，从而减轻肺组织损伤，提高海水淹溺大鼠的存活率。

人参皂苷Rg1潜在的分子受体可能包括糖皮质激素受体和雌激素受体，抗炎抗氧化功能与Nrf2/HO-1、NF- NF- κB和Ampk等信号通路相关，具有抗炎抗氧化且不良反应小等特点，随着研究的不断深入，Rg1的药物研发与临床应用将具有广阔的前景。