淋巴结活检组织EBER原位杂交检测条件优化探讨

肖玉娇，李三恩，朱卫东，石晨曦

（1.山西省晋城市人民医院病理科，山西 晋城 048000；2.苏州大学附属第一医院病理科，江苏 苏州 215006）

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）属疱疹科病毒，是一种人类特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒[1]。已有研究[2]表明多种淋巴瘤的发生、发展过程与EBV感染密切相关，包括弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、NK/T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤等。EBV相关淋巴组织疾病诊断相对困难，原位杂交检测肿瘤细胞中EBV编码的小RNA（EBV encoded RNA,EBER）是诊断肿瘤是否EBV相关的重要手段[3]。淋巴结活检样本常常是初次确诊样本或治疗后评估确诊样本，是诊断和疗效评价的“金标准”，因此探究最适宜的检测条件至关重要。本研究从切片厚度、胃蛋白酶消化时间、杂交时间三方面对淋巴结活检组织设置梯度检测，探究最适宜检测条件。

1 材料与方法

1.1 材料 选取苏州大学附属第一医院2019年—2020年EBER阳性相关病例11 例，标本类型为淋巴结活检组织，其中NK/T淋巴瘤3 例，血管免疫母细胞性淋巴瘤1 例，HL 3 例，DLBCL 4 例。所有标本均经规范取材并用10%中性福尔马林固定。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：EBER检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，主要试剂包括：胃酶工作液，HRP标记抗地高辛抗体，DAB底物缓冲液，DAB浓缩显色液，PBS缓冲液粉末pH7.3，Tween-20，地高辛标记的EBER探针；其他试剂：脱蜡液、乙醇（无水、95%、75%）、去离子水、橡胶水泥、中性树胶、苏木素染色液等。

1.2.2 仪器：切片机（LEICA RM2235），电热恒温箱等。

1.3 方法 EBER原位杂交检测，试剂盒推荐步骤如下：切片脱蜡至置于无水乙醇中，浸泡3 min×3次，空气干燥5 min；每张切片滴加足够量的胃酶工作液，37 ℃孵箱孵育5～30 min；弃去胃酶工作液，梯度乙醇脱水（75%，95%，100%各2 min），空气干燥；切片滴加5～10 μL地高辛标记的EBER探针，加硅化盖玻片，橡胶水泥封边，37 ℃杂交孵育2～4 h或过夜（孵育盒内保湿）；PBS缓冲液洗去盖玻片；PBS缓冲液洗2 min×3 次；滴加30～50 μL HRP标记抗地高辛抗体，37 ℃孵育30 min；PBS缓冲液冲洗2 min×3 次，暗处DAB显色5～10 min；蒸馏水冲洗，苏木精复染5～10 s；分化、冲洗反蓝；乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。每次杂交实验，均有阳性、阴性对照同时进行，阳性、阴性对照经过验证。

1.4 结果判定 染色结果由有资质的病理医生对染色后的组织片在光学显微镜下观察并进行判读。判读标准：DAB显色后，杂交阳性信号位于细胞核，呈棕褐色，杂交阴性的细胞的胞核经苏木精复染成蓝色。

2 结果

2.1 不同切片厚度EBER检测结果 淋巴结活检组织切片厚度分别为1 μm，2 μm，3 μm，4 μm，5 μm共5组，胃蛋白酶消化时间采用试剂盒推荐30 min，杂交孵育过夜。比较发现，1 μm组阳性信号不均，5 μm组细胞重叠明显，苏木精背景染色较深，影响观察，其他三组染色效果接近。提示淋巴结活检组织切片厚度选(3±1)μm均可，其中，切片3 μm时EBER检测更稳定，效果更好，背景干净，结果清晰易辨。

2.2 不同胃蛋白酶消化时间EBER检测结果 选择切片厚度3 μm，胃蛋白酶消化时间范围5～30 min，进行5 min间隔的梯度时间消化，共6组，杂交孵育过夜。6组检测结果显示，胃蛋白酶消化5～15 min阳性信号较弱，低倍镜下不易观察，消化20～30min的组织杂交效果好，阳性细胞着色深，定位准确，无非特异性背景染色，因此，淋巴结活检组织可缩短消化时间为20 min（图1）。

2.3 不同杂交时间EBER检测结果 在切片厚度3μm，胃蛋白酶消化20 min条件下，探针孵育时间设置2 h，4 h，过夜（16 h），共3组。结果显示染色质量无明显差异，杂交成功率高（图2），提示淋巴结活检组织EBER探针杂交时间可缩短至2～4 h。

图1 不同消化时间EBER染色结果。A-F：蛋白酶消化时间分别为5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min。

图2 不同探针杂交时间EBER染色结果。A-C：探针杂交时间分别为2 h，4 h，过夜（16 h）。

3 讨论

恶性淋巴瘤种类繁多，发病机制复杂，近年来，淋巴瘤已成为发病率速度增长最快的淋巴造血系统恶性肿瘤[4]。大量研究发现EBV在伯基特淋巴瘤（BL）、NK/T细胞淋巴瘤、DLBCL及HL中检出率显著高于其他种类，推测EBV可能在肿瘤发病过程中起到重要作用。

EBER是EBV编码的mRNA，在EBV感染的细胞核中高拷贝存在。原位杂交，可以对靶序列进行组织、细胞的空间定位。EBER原位杂交法因其准确的定位、极高的特异性和灵敏性已成为公认的EBV标准检测方法，并作为病理辅助诊断的重要依据之一[5-6]。

由于原位杂交检测步骤多，容易受各种因素（如组织标本的预处理、标本类型、胃蛋白酶的消化程度、杂交温度及时间等）的影响。原位杂交操作流程的规范性至关重要，在日常检测过程中，我们发现，干片、PBS清洗不足、DAB显色时间过长等因素有可能引起组织内非特异性背景染色。苏木素复染时间也不宜过长，否则会掩盖拷贝数特别低的标本阳性显色，影响判读。

本研究中，选取的标本类型为淋巴结穿刺活检组织，浅表淋巴结穿刺活检及B超、CT引导下的深部淋巴结穿刺活检创面小，安全系数高。尽管活检组织多方向、多点取材等，仍有取材少或者涂片不清等易致漏诊；且病理诊断往往被认为是诊断的金标准，对病理医师的要求较高。在实际工作中，穿刺取样还可能对组织形态结构造成不可逆影响，从而破坏细胞内蛋白及核酸的保存，并且，因穿刺组织较小，细胞丰富，处理不当易使组织收缩、变脆，制片需严格控制固定、脱水、透明、进蜡过程的时间及所用试剂的浓度。

为探索淋巴结穿刺活检组织最适EBER原位杂交检测条件，比较了不同切片厚度、不同蛋白酶消化时间、不同探针孵育时间下EBER原位杂交检测的染色质量情况。切片过薄，不能保证切片中足够的EBER核酸拷贝数，且手工检测酶消化时间不容易把握阳性信号强度较弱；切片过厚，细胞重叠不利于观察。酶消化的作用是增加组织的通透和增强探针的穿透，胃蛋白酶消化不足将影响探针与目标核酸杂交的结合程度，引起阳性减弱或假阴性等检测结果；消化过度核酸周围的蛋白结构会被破坏，在接下的实验中核酸易丢失[7-8]。在以往的检测中，为保证低拷贝样本杂交效果，防止假阴性出现，常采用过夜杂交，在本研究中对2～4 h杂交效果也进行了比较。

目前最常用的原位杂交试剂分别有适用于手工和全自动免疫组化染色仪两种类型的试剂盒，二者各有优缺点。传统EBER检测方法简单易操作，但过程较长，总耗时近20 h，且易受环境及人为因素影响。全自动检测实验所需时间短，程序自动化控制，有利于质量标准化管理[9]，但已有研究[10]表明，在穿刺活检组织中，手工染色检测与全自动染色检测相比，具有相对更好的特异性和敏感性，提示并非所有组织类型标本都适用于全自动检测。

在本研究中，对淋巴结穿刺活检组织的传统EBER检测条件进行优化，节省了整体检测时间，实验效果更佳，在病理诊断提速的同时更好地为临床治疗提供了可靠的依据。