难治性分化型甲状腺癌患者抗VEGF抗体Fab片段筛选鉴定的实验研究

吴飞飞 张承宇 卢朝秀 段 涛 申虎威

甲状腺癌的发病率在世界范围内迅速上升[1]。大多数甲状腺癌患者经手术及I131放射治疗等规范化治疗后预后良好，但仍有约23%的患者发生远处转移甚至恶化，最终确诊为难治性分化型甲状腺癌，10年生存率仅为10%左右[2]。因此，对难治性分化型甲状腺癌针对性治疗的研究迫在眉睫。

肿瘤血管再生是癌症进展和代谢的重要标志[3-4]，同时血管内皮生长因子(Vascular endthelial growth factor,VEGF)在介导肿瘤血管生长的过程中发挥着重要作用[5]，许多抗肿瘤研究都集中在抑制VEGF信号传导[6-7]。有动物实验表明，系统性给予VEGF单克隆抗体可抑制甲状腺乳头状癌的生长[8]，该结论为利用人源化VEGF单克隆抗体治疗难治性分化型甲状腺癌提供了可靠证据，但由于人源化抗体多来源于小鼠等动物，存在与人体产生免疫反应等副作用，而来自于人体细胞克隆的抗体，即人源性抗体给患者施用时可减少免疫反应[9-10]。

本研究建立了一个由难治性分化型甲状腺癌患者外周血淋巴细胞构建的噬菌体展示文库，并利用重组人VEGF对该文库进行筛选。经过四轮酶联免疫吸附测定(ELISA)法对阳性菌落的筛选，并通过测序和蛋白质印迹进一步分析获得了抗VEGF抗体Fab克隆片段，最后利用细胞水平抑制试验测试它们对VEGF的抑制活性。

1 材料和方法

1.1 细胞

使用人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自上海细胞库)进行细胞增殖试验来检测VEGF的活性[11-12]，该效应的ED50(半数有效量)为3 μg·mL-1。

1.2 RNA制备和表达载体构建

取含高滴度VEGF抗体的甲状腺癌患者外周静脉血10 mL，使用淋巴细胞分离培养基(Pharmacia)离心分离淋巴细胞，用Trizol试剂提取总RNA作为合成cDNA模板，并做RT-PCR(Invitrogen)。使用抗体Fab片段DNA的特异性引物[12]，扩增重链的VH区和κ、λ轻链。PCR反应条件：95 ℃，变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min后在72 ℃下孵育10 min。扩增的κ和λ轻链用XbaI和SacI消化，并进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。使用Qiagen试剂盒提取目的条带。将纯化的DNA与XbaI/SacI线性化的pComb3-H载体连接。随后，用过量的限制性内切酶XhoI和SpeI切割重链Fd片段，并克隆到含有轻链的XhoI/SpeI线性化的pComb3-H中。将重组DNA分子转化到感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF细胞(Invitrogen)上，提取XL1-Blue MRF样品(10，1，0.1 μL)进行铺板，以确定转化效果。随机抽取几个XL1-Blue MRF单克隆质粒用限制性内切酶切割验证靶序列。

1.3 噬菌体文库的包装

电穿孔后将阳性克隆接种到50 mL 2×YT培养基(含有100 μg·mL-1氨苄西林，30 μg·mL-1四环素，100 mmol葡萄糖)上摇菌至OD600达0.025。培养物在37 ℃孵育2 h。在OD600值为0.1时，加入最大量=8的辅助噬菌VCS-M13(1012pfu)。37 ℃下以80 r·min-1离心30 min，再以260 r·min-1离心30 min。将培养物以4 000 r·min-1速度离心，加入100 μg·mL-1氨苄西林和50 μg·mL-1卡那霉素将培养基改变为40 mL 2×YT，培养物在30 ℃下继续培养6 h，之后再次将培养物离心，上清液加入聚乙二醇、氯化钠至其浓度分别为4%和3%。再将噬菌体文库在4 ℃下沉淀12 h，然后以8 000 r·min-1离心30 min，将噬菌体沉淀重新悬浮在PBS(pH 7.4)中，并转移到微量离心管中，以14 000 r·min-1转速进行最后1次离心10 min，除去不溶性物质。构建引物Fab噬菌体展示文库。

1.4 抗VEGF Fab噬菌体展示文库的筛选

在4 ℃恒温下用200 μL重组人VEGF-A抗原在微滴板孔上涂敷12 h。3%BSA阻断后，向每个孔中加入50 μL噬菌体悬浮液(约107pfu)。将与抗原结合的噬菌体从孔中洗脱，再次感染XL1-Blue MRF。最后再添加VCS-M13，即完成一轮筛选。经过5轮筛选后，产量噬菌体的百分比确定为(筛选的噬菌体数量/应用的噬菌体数量)×100。

1.5 Fab片段的ELISA分析

用200 μL重组人VEGF-A蛋白抗原在微滴板孔上涂敷12 h，用HEK293 T细胞全细胞裂解液作为阴性对照，后将微量滴定板用PBS-3% BSA阻断1 h；用PBST广泛洗涤后，在每个微量滴定板的孔中加入50 μL抗VEGF Fab噬菌体展示库悬浮液，并在37 ℃环境中培养2 h；之后再用PBST洗涤3次后，加入50 μL按照1∶20 000比例稀释的与辣根过氧化物酶结合的山羊抗人Fab，37 ℃孵育1 h；最后添加50 μL TMB显色液，在490 nm处检测显色。阳性克隆的A490值比阴性克隆高至少2倍，用1 mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)处理、筛选并诱导克隆，通过离心回收细胞，并重新悬浮在PBS中；将悬浮液在-70 ℃彻底冷冻后在37 ℃下完全解冻，操作5次以提取Fab抗体，然后以10 000 r·min-1速度离心，用ELISA检测上清液中的抗体；每种抗体测试5次。

1.6 VEGF特异性Fab克隆片段的序列分析

西格玛生物技术公司对6个克隆片段(2、6、15、16、22和25)的重链和轻链可变区进行了核苷酸测序，测定每个克隆的双链核苷酸序列；利用DNA Strider和Clustal软件对VEGF特异性抗体Fab片段的VH和VL氨基酸序列进行进一步分析。

1.7 VEGF特异性抗体Fab片段的蛋白质印迹分析

蛋白印迹分析实验步骤见试剂盒说明(抗体浓度为1∶2稀释的抗体Fab6、Fab16，1∶200稀释的阳性血清和1∶500稀释的抗人GAPDH)。

1.8 细胞增殖法分析Fab片段抑制活性

融合的HUVECs用PBS清洗2次，然后使用内皮细胞基础培养基(EGM-2，不含血清或生长因子，只含抗生素)加入0.001～1 mM浓度的Fab片段(Fab2、Fab6和Fab16)；分别孵育4 h和24 h后，用25 ng·mL-1重组人VEGF-A蛋白刺激5 min；处理后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液溶解细胞；通过双喹啉酸法测定裂解物的蛋白质含量，从第1天至第5天，每隔24 h测1次OD值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 抗VEGF Fab基因的克隆

将PCR扩增的κ/λ链产物经适当的限制性内切酶消化后连接到pComb3-H载体上，通过电穿孔法导入大肠杆菌XL1-Blue MRF；氨苄西林耐药克隆的滴定表明轻链文库包含6×106个独立克隆；将PCR扩增的重链产物与轻链文库中提取的DNA连接，生成含有3×107个克隆的噬菌体展示Fab文库；随机挑选16个克隆基因并进行分析，轻链和重链插入效率分别约为55.3%和31.2%。

2.2 抗VEGF抗体Fab片段的ELISA分析

利用重组人VEGF-A蛋白对文库进行筛选；经过5轮筛选后，将获得的噬菌粒DNA导入大肠杆菌XL1-Blue MRF表达抗VEGF抗体Fab片段，并通过ELISA检测每个克隆；6个克隆(2，6，15，16，22，25)在ELISA试验中均表达了重组人VEGF-A蛋白结合的Fab抗体，6个克隆都表现出与VEGF-A蛋白的结合活性，都未表现出与HEK 293 T细胞的全细胞裂解物的任何结合活性；其中Fab6、Fab16与重组人VEGF-A蛋白的结合活性明显高于其他4种，见表1。

表1 克隆片段与重组人VEGF-A蛋白的结合活性

2.3 VEGF特异性Fab克隆的序列分析

对6个克隆的重链可变区和轻链可变区序列分析表明，它们的重链可变区(VH)序列与抗原表位直接相互作用的互补决定区(CDRS)有12个显著差异。它们来自不同的种系VH片段，也有体细胞超突变。相比之下，轻链可变区(VL)序列源自人VK1家族的DPK9种系片段，并且彼此高度同源。见表2。

表2 Fab6和Fab16的重链可变区和轻链可变区序列

2.4 蛋白质印迹法分析抗体的特异性和亲和力

通过蛋白质印迹法进一步鉴定了在ELISA中活性较高的2个克隆片段(Fab6和Fab16)的结合活性。结果表明，每种抗体都能特异性结合重组人VEGF-A蛋白，尤其是Fab6片段活性更强。它们都没有显示出与HEK 293 T细胞的全细胞裂解物的任何结合活性。见图1。

图1 VEGF抗体Fab片段的蛋白印迹法分析

2.5 细胞增殖法对Fab片段抑制活性的分析

通过细胞增殖试验(MTT法)测试3个克隆片段的抑制活性(Fab2、6、16)。3次实验结果一致，3个克隆片段均表现出抑制活性，其中Fab6片段显示出明显的抑制活性，Fab16片段显示出较弱的抑制活性，差异有统计学意义，见图2、表3。

图2 MTT法对Fab片段抑制活性比较

表3 MTT法检测Fab片段抑制活性比较

3 讨论

为筛选出可靠的人源性VEGF单克隆抗体，本研究使用重组人VEGF-A蛋白对高亲和力的Fab片段进行筛选，并鉴定了一组共6种结合重组人VEGF-A蛋白的Fab片段，筛选出2种与重组人VEGF-A蛋白高度结合的Fab片段。筛选程序是从最初由帕尔马利和史密斯创立的程序修改而来[13-14]。除去非特异性抗体噬菌体后，结合噬菌体在大肠杆菌XL1-Blue MRF中洗脱并扩增。该富集过程重复5个循环，测试每轮筛选后从克隆基因中表达的可溶性Fab片段对重组人VEGF-A蛋白的结合特性。由于重组人VEGF-A蛋白是由HEK 293 T细胞产生的，因此以HEK 293 T细胞全细胞裂解液为阴性对照，所有6种Fab片段对HEK293 T细胞的全细胞裂解液均无结合活性。

丝状噬菌体是鉴定肽或蛋白质药物的有力工具[15-18]。本研究使用1例具有高滴度VEGF抗体的难治性分化型甲状腺癌患者的外周血，通过RT-PCR法、载体构建、ELISA、MTT等实验初步构建了1个Fab形式的简单噬菌体抗体库，并成功从噬菌体库中筛选并分析了6种Fab片段，均与VEGF具有结合活性，并能够在体外阻断人类脐静脉内皮细胞HUVEC中VEGF的表达；说明建立噬菌体抗体库技术可为人源性抗体的制备提供一条更为便捷的途径，可推动对肿瘤抗原及肿瘤免疫治疗的研究，为难治性分化型甲状腺癌的治疗提供一定的研究基础，为治疗VEGF相关的癌症提供了更多的可能性。

综上所述，本研究显示噬菌体展示技术可用于筛选人源性VEGF单克隆抗体，可作为一种潜在的药物发现工具，为难治性分化型甲状腺癌患者的药物治疗研究奠定基础。