链霉菌AJ56的生理生化特性研究

吴 佳

链霉菌AJ56是分离自缬草根际部位的放线菌。缬草作为一种重要的药用植物资源，富含多种化学成分,分别有挥发油、黄酮、生物碱、环烯醚萜、木脂素等[1-5]。丰富的化学成分使得缬草具有多种药理作用[6]。前期研究表明，链霉菌AJ56含有卤代酶类抗生素生物合成基因。在高通量药物筛选中，一般的化合物都具有卤族元素[7],相当一部分的次生代谢卤化物具有抗菌和抗癌等生物活性，具有较高的药用活性价值[8]，如硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin)、万古霉素(Vancomycin)、金霉素(Chlorotetracyline)等具有显著的抗菌活性，抗肿瘤药物蝴蝶霉素(Rebeccamycin)，刺孢霉素(Calicheamycin)以及抗HIV药物(ChloropeptinⅠ，Ambigol A)等[9]。因不同的菌含有不同的酶系统，对营养物质的分解能力不同，因而代谢产物各有不同，本研究围绕缬草根际部位链霉菌AJ56的生理生化特性展开研究，用生化试验方法检测链霉菌对各种营养物质的代谢作用及其代谢产物，为进一步挖掘该菌株的生防应用价值及发现新的次级代谢产物提供基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

本实验室保存的菌株AJ56是从缬草根际分离的含卤代酶类抗生素基因的链霉菌。

1.2 方法

1.2.1菌株AJ56的形态特征观察 本研究以链霉菌AJ56为材料，对其进行盖玻片爬片法培养，在场发射扫描电镜下观察其形态特征。首先选用6种放线菌培养基(高氏一号，GSY，2×CMY，YMS，ISP4和MS)培养菌株AJ56，观察其在不同培养基上的生长状况；再选择最适培养基对菌株AJ56进行划线(单条线)培养，1 d后在培养基划线处插片；待其长出孢子后开始处理菌株，经2.5%的戊二醛处理，4 ℃过夜固定后对菌株标本进行漂洗及脱水处理，经乙酸异戊酯溶液处理，干燥后在场发射扫描电镜下观察其形态特征。

1.2.2菌株AJ56的生理生化试验 (1)菌株AJ56的碳氮源利用试验：本研究选择的碳源包括乙酸钠、柠檬酸钠、甘露醇、肌醇、葡萄糖、木糖、甘油、山梨醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和草酸钠；氮源包括色氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在基础培养基中分别添加不同碳源，使终浓度为1%。添加氮源终浓度为0.5%。观察菌株AJ56在不同碳源和不同氮源下的生长情况。(2)菌株AJ56的其他生理生化试验：①温度耐受试验，分别在4 ℃、28 ℃、37 ℃条件下培养观察菌株AJ56的生长状况。②盐耐受试验，TSB培养基中按浓度梯度分别加入0、1%、3%、5%、7%、10%的NaCl(质量体积比)，将菌株AJ56的孢子分别接种到不同NaCl浓度的TSB培养基中，平均2 d观察其生长状况，培养15 d后结束观察。③明胶液化，将菌株AJ56接种至明胶培养基中，同时取一支未接菌的作对照，28 ℃培养14 d，每2 d观察1次明胶液化程度。④淀粉水解试验，取菌液点种(约4～6个)于培养基上，28 ℃培养4～7 d。待菌落长成后滴加路哥氏碘液，观察菌落周围是否产生透明圈。⑤纤维素分解试验，将菌株AJ56分别在含纤维素与不含纤维素的培养基上培养(28 ℃培养4～7 d)观察菌的周围是否有晕环。⑥牛奶凝固与胨化，将菌株AJ56转接到脱脂牛奶培养基中(28 ℃培养)共培养14 d，每2 d观察记录1次牛奶是否形成凝块并分解。

2 结果

2.1 菌株AJ56的形态观察

经6种放线菌培养基培养菌株AJ56(见图1)发现其在高氏一号生长较好，菌丝呈白黄色，孢子产量丰富。经插片培养处理，在场发射扫描电镜S-4800下观察，由于培养时间较长，基丝基本处于断裂状态，无隔。菌株AJ56的基丝直径约0.5～0.8 μm，孢子呈短杆状，长约1.4～1.5 μm，表面结构为圆头形刺状凸起，见图2。

图1 菌株AJ56在高氏一号培养基上的菌落形态

图2 AJ56孢子扫描电镜图

2.2 菌株AJ56的生理生化试验

2.2.1菌株AJ56的碳氮源利用试验 本研究选用13种常见的碳源培养基培养菌株AJ56，发现其可以利用多种碳源，但不能将草酸钠作为唯一碳源进行生长，见表1。选择11种常见的氮源培养基培养，发现多种氮源可以满足其生长，但是天冬氨酸和谷氨酸不能作为唯一氮源满足菌株AJ56的生长，见表2。

表1 菌株AJ56碳源利用试验结果

表2 菌株AJ56氮源利用试验结果

2.2.2菌株AJ56的其他生理生化试验 其他生理生化试验培养菌株AJ56发现：其在3种温度下都能生长，但是4 ℃和37 ℃条件下生长较慢；该菌株可在含有7% NaCl的培养基中生长，耐盐程度相对较强；并且可以使明胶液化，产生淀粉酶将淀粉分解以及将纤维素降解，但是不能将牛奶胨化，说明该菌株不产生凝乳酶和蛋白酶。见表3。

表3 菌株AJ56其他生理生化试验特征

3 结论

链霉菌属(Streptomyces)放线菌是一类高G+C含量的革兰氏阳性菌，因能产生多种重要的天然化合物被人们广泛关注。目前己知的抗生素大多数是由链霉菌产生，约占已经发现抗生素总数的2/3[10]。这些化合物中有抗细菌、抗真菌或其他活性的，例如由链霉菌ATCC14,046产生的具有抗分支杆菌作用的罗非霉素、由灰色链霉菌产生的广谱抗生素-链霉素等,还有其他许多免疫抑制剂、抗癌药物、抗虫剂及其他胞外水解酶等[11]。

本研究围绕链霉菌AJ56生理生化特性展开研究，以便初步了解该菌株的酶系统以及代谢能力。通过场发射扫描电镜对菌株的菌体形态观察发现该菌株的基丝直径约0.5～0.8 μm，菌落偏黄色，孢子呈短杆状，长约1.4～1.5 μm，表面结构为圆头形刺状凸起。再研究其对不同碳氮源的利用效果，发现菌株AJ56能利用柠檬酸钠、甘露醇、肌醇、葡萄糖、木糖、甘油、山梨醇、海藻糖、乳糖、麦芽糖和乙酸钠，不能利用草酸钠作为唯一碳源。可以利用色氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸和精氨酸作为唯一氮源，但不能利用天冬氨酸和谷氨酸作为唯一氮源。菌株AJ56可在含有7% NaCl的培养基中生长，耐盐程度相对较强，并且可以使明胶液化，产生淀粉酶将淀粉水解，同时具有降解纤维素的能力，但不能产生凝乳酶和蛋白酶。总之，通过生理生化特性研究发现，链霉菌AJ56具有较好的生理生化特性，便于后期开展该菌株的生防机理研究及相关的卤代酶类基因功能研究。