大麻二酚对高糖诱导小鼠肾脏足细胞系MPC5细胞凋亡的保护作用

苏静华，焦 婷，韩 宁，苏静克，党瑞杰，李 琳，张海松

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一，30%～40%的糖尿病患者可出现肾脏损害。蛋白尿是DN主要的临床表现，是由肾小球滤过屏障损害造成的。肾小球滤过屏障包括内皮细胞、基底膜和足细胞，而足细胞对于维持肾小球滤过屏障的完整性至关重要。足细胞相关蛋白，如Nephrin、podocin等，构成了肾小球滤过屏障的分子筛，是保障滤过功能的重要分子屏障。这些足细胞相关蛋白的异常会损害过滤屏障结构的完整性和稳定性，从而引起蛋白尿。细胞凋亡是足细胞数量减少的主要原因，而且足细胞是终末分化细胞，不能再生。因此，抑制高糖环境诱导的足细胞凋亡是防治DN的重要手段。

大麻二酚(cannabidiol, CBD)是无精神活性的天然大麻素类提取物，具有抗炎、镇痛、改善睡眠和抗肿瘤等多种生物学效应。最近，动物实验表明，CBD能抑制诱导糖尿病心肌病变的细胞死亡信号，CBD干预有助于降低1型糖尿病小鼠胰腺早期炎性反应，CBD能缓解高糖诱导的氧化应激损伤。但是，CBD能否抑制高糖诱导的足细胞凋亡尚不清楚。本研究以小鼠肾脏足细胞系MPC5为实验对象，探讨CBD对高糖环境中MPC5细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器 小鼠肾脏足细胞系MPC5，购自北京北纳创联生物；1640培养液、胎牛血清(美国Gibco)；CBD(云南汉木森生物)；CCK-8检测试剂盒(上海碧云天生物)；BCA(bicinchoninic acid)测定试剂盒(中国博迈德)；FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒(美国BD)；预制胶电泳液(中国索莱宝)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美国Millipore)；脱脂奶粉(美国BD)；兔抗小鼠Nephrin抗体(稀释比例1∶1000，武汉博士德)；Bax、Bcl-2抗体(稀释比例1∶1000，美国Cell Signaling Technology)；小鼠β-肌动蛋白抗体(β-actin；稀释比例1∶200，武汉博士德)。

Herocell 180型二氧化碳恒温培养箱(上海润度生物)；2104 Envision型多功能酶标仪(美国PerkinElmer)；CytoFLEX 型流式细胞仪(美国 Beckman Coulter)；DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)；FlourChem FC12型凝胶成像分析仪(美国Alpha)。

1.2 细胞培养 将MPC5细胞复苏后，加入含10%胎牛血清和50 U/ml的γ-干扰素的1640培养液中培养(葡萄糖含量为5.5 mmol/L)，置于33 ℃的二氧化碳培养箱中。当细胞铺满瓶底面积的70%～80%时，去除培养液中的γ-干扰素，将细胞转移至37 ℃的二氧化碳培养箱中诱导分化1～2周。分化好的MPC5细胞用于后续实验。

1.3 细胞增殖 将MPC5细胞接种到96孔板，分别加入30 mmol/L葡萄糖(high glucose, HG)和不同浓度的CBD(0.5、2.5、5 μM)。分别于接种后1～7 d，每天按照试剂盒说明书检测细胞增殖活性(每组3个复孔)：每孔中加入10 μl CCK-8液，避光孵育2 h，于波长492 nm处检测吸光度值(OD值)。因不同浓度的CBD可呈浓度依赖性地提高高糖环境中MPC5细胞的增殖活性且有饱和性。所以，后续实验采用2.5 μM作为CBD的干预浓度。

1.4 细胞凋亡 将MPC5细胞分为3组：对照组(Vehicle)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖，HG)和CBD组(30 mmol/L葡萄糖+2.5 μM CBD)，各组细胞干预48 h后进行检测。收集各组细胞的单细胞悬液，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，分别混匀，于室温下避光孵育10～15 min上机检测。采用FlowJo 10.3软件对实验结果进行分析：左上象限(Q1)为细胞死亡百分比，右上象限(Q2)为晚期凋亡百分比，右下象限(Q3)为早期凋亡百分比，左下象限(Q4)为活细胞百分比，细胞凋亡率= Q2+Q3。

1.5 Western blot 细胞分组及处理时间同1.4细胞凋亡。取各组细胞，PBS缓冲液冲洗后加入细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白。取50 μg总蛋白上样后，进行电泳。然后在220 mA的条件下转膜2 h，再室温封闭2 h，分别滴加特异性一抗封闭过夜，再以辣根过氧化物酶标记的二抗封闭2 h。最后，用化学发光剂染色、显影并采用BandScan 5.0软件分析胶片灰度。所有实验至少重复3次。

2 结 果

2.1 CBD对高糖环境中小鼠肾脏足细胞系MPC5增殖的影响 如表1所示，与Vehicle组相比，HG组MPC5细胞的增殖活性显著降低(<0.05)，而不同浓度的CBD干预呈浓度依赖性地提高高糖环境中MPC5细胞的增殖活性。而且，2.5 μM CBD与5 μM CBD提高MPC5细胞增殖活性的作用差异无统计学意义。因此，本研究采用2.5 μM作为后续实验的干预浓度。

2.2 CBD对高糖环境中小鼠肾脏足细胞系MPC5细胞凋亡的影响 如图1所示，与Vehicle组相比，HG组MPC5细胞的凋亡比例显著增加[(25.27±2.15)%(8.43±0.70)%;<0.05]，而CBD干预能明显降低MPC5细胞的凋亡比例，差异有统计学意义[(12.83±1.05)%(25.27±2.15)%;<0.05]。

2.3 CBD对高糖环境中小鼠肾脏足细胞系MPC5细胞Nephrin及凋亡相关蛋白表达的影响 如图2和图3所示，与Vehicle组相比，HG组MPC5细胞的裂孔膜蛋白Nephrin蛋白表达显著降低，而CBD干预能明显升高MPC5细胞Nephrin蛋白的表达(<0.05)。而且， HG组促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达比升高，与Vehicle组相比，差异有统计学意义(<0.05)；而CBD干预能显著降低高糖环境中MPC5细胞促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达比(<0.05)。

3 讨 论

本研究以高糖环境中的小鼠肾脏足细胞系MPC5为研究对象，发现CBD能促进高糖环境中MPC5增殖，降低高糖诱导的MPC5细胞凋亡率并降低促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的表达比，还能促进裂孔膜蛋白Nephrin蛋白表达。

足细胞凋亡在DN发病过程中发挥重要作用。高糖环境中，活性氧产量增加，进而激活p38 MAPK信号途径促进足细胞凋亡。而且，糖基化终末产物也能通过激活FOXO4的转录表达促进足细胞凋亡。本实验也发现，高糖环境可诱导足细胞系MPC5细胞凋亡。在生理状态下，细胞同时接受促凋亡信号和抗凋亡信号的刺激，只有这两种信号处于动态平衡状态，内环境才能保持稳定。本研究发现，高糖环境中MPC5细胞促凋亡蛋白Bax的表达升高，同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低。Nephrin是表达于足细胞连接处的一种黏蛋白，构成足细胞裂孔膜的关键成分，对于维持肾小球的滤过屏障功能具有重要作用。而且，Nephrin表达下降也是蛋白尿形成的重要原因。本研究发现，在高糖环境中，足细胞功能蛋白Nephrin的表达也发生了下调。

CBD是从植物大麻中提取的纯天然成分，CBD主要通过两种CBD受体CB1和CB2发挥胞内作用。在生理状态下，足细胞低表达CB1受体，高表达CB2受体。无论是1型糖尿病模型还是2型糖尿病模型中，足细胞均过表达CB1受体。与之相反，在人终末期DN病理标本中，足细胞CB2受体的表达却明显下调。动物实验表明，CBD对DN具有潜在的保护作用。例如：CB1受体抑制药利莫那班能预防肥胖ZDF大鼠蛋白尿产生，减少肾小球损伤，改善白蛋白肌酐比等。本研究发现，CBD对高糖环境中的足细胞具有直接的保护作用：(1)CBD干预缓解高糖对足细胞增殖的抑制作用；(2)CBD缓解高糖诱导的足细胞凋亡和促凋亡蛋白的表达并促进抗凋亡蛋白的表达；(3)CBD能促进高糖环境中足细胞功能蛋白Nephrin的表达。但是，CBD受体在CBD缓解高糖诱导的MPC5细胞凋亡中的作用本研究未进一步探讨，这是本文的一个局限。

综上所述，本研究发现CBD可在体外抑制高糖诱导的小鼠足细胞系MPC5细胞凋亡，CBD有望被开发成抑制高糖环境中足细胞凋亡并进而缓解DN的一种潜在药物。