一种调控干细胞分化的光响应智能生物材料的制备

于钊江，赵春雪

（安阳师范学院1.化学化工学院；2.数学与统计学院，河南 安阳 455000）

干细胞因具有高度的自我复制、增值和多向分化的潜能而备受关注［1］。大量的体外实验结果表明，在生长因子、趋化因子等生物大分子或力学因素作用下，体外培养的干细胞具有向某个方向特定分化的潜能。近年来，力学微环境被认为是一种强有力的影响干细胞分化的物理因素，引起越来越多的关注。

基于力学微环境对干细胞分化的影响，大量体外调控干细胞分化的生物材料被成功制备。如SAHA 等［2］制备了一种含有不同硬度表面精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸多肽（RGD）序列的互穿聚合物网络，不同的基底硬度影响黏着斑的生长和延伸，从而调控干细胞的分化；文献报道，KILIAN等［3］、MCBEATH 等［4］、KURPINSKI 等［5］设计了圆形、方形、星形、条纹、网格、微槽、微桩等多种微图案表面，利用微图案表面调控干细胞的分化；另外，研究者选择利用外部设备通过一定的应力类型和加载方式对不同基底材料进行机械循环拉伸，进而调控干细胞的分化，如双轴拉伸［6］、单轴拉伸［7］、单轴压缩［8］等。但是，机械拉伸模式存在价格昂贵、操作繁琐、可重复性差等问题，越来越多的研究者将目光转向刺激响应性智能材料的设计，如KIZILKAN 等［9］利用偶氮苯类液晶弹性体的光敏特性，成功制备了一种光刺激响应的复合材料；DEFOREST 等［10］利用两个离子正交光化学实现了生物活性全长蛋白的可逆固定化，实现了人间充质干细胞的可逆分化调控；FUHRER 等［11］合成了一种软性磁性水凝胶，通过磁场控制水凝胶的循环变形，诱导间充质干细胞向软骨细胞分化；LIM 等［12］制备了一种电响应水凝胶多功能基质，可以通过水凝胶交联密度和电势梯度调节可逆调节水凝胶的各向异性弯曲。基于此，本文将单壁碳纳米管（SWNTs）、聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）通过光交联的方式制备双层水凝胶，基于光热能量转换机理，对双层水凝胶进行可逆形变调控，从而制备一中新型可用于智能调控干细胞分化的生物材料。

1 材料和仪器

主要材料和仪器：SWNTs，高纯，上海巷田纳米材料有限公司；N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N，N-亚甲基双丙烯酰胺（BisAA）、过二硫酸铵（APS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、二苯甲酮功能化KGYSGRGDSPAS（BP-RGD），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；近红外激光光源，功率最大5 W，中川光电。

2 实验方法

2.1 SWNTs-PNIPAM 水凝胶制备

①羧基化SWNTs 处理。未修饰的SWNTs 在2.6 mol/L 的硝酸中回流45 h，然后酸纯化的SWNTs在35～40°C 的硫酸和硝酸混合液（H2SO4/HNO3，3∶1，98%和70%）中处理24 h，引入羧基。②重结晶NIPAM。取5 g NIPAM 溶解于60℃的8 mL 甲苯中，再加入20 mL 正己烷重结晶。重复上面步骤两次，放入真空干燥箱中干燥，然后密封放4℃的冰箱内保存。③NIPAM（791 mg,7 mmol），BisAA（5.47 mg,0.035 mmol），TEMED（7.7 mg,10 μL），羧基化SWNTs（4.3 mg）溶于10 mL 水中。④液面下通氮气并搅拌60 min 除去水中残余氧气。然后将4.0 mg APS，即重量百分比20%（20 wt%）水溶液20 μL 加入到溶液中。⑤迅速倒入自制的模具中（体积为2 cm×1 cm×0.2 cm），室温下，紫外照射24 h，使完全聚合。模具由2 个载玻片和橡胶垫圈制作。⑥制备好的水凝胶浸泡在透析袋（3 500 mm）中，在去离子水中浸泡并搅拌5 h，除去未反应完的单体和其他杂质。

2.2 SWNTs-PNIPAM 双层水凝胶制备

①将NIPAM 单体、引发剂和交联剂混合液，迅速倒入模具中SWNTs-PNIPAM 水凝胶层上表面，用盖玻片使厚度达到2 mm；然后，室温下紫外照射24 h，使完全聚合。②将制备好的双层水凝胶浸泡在去离子水中，除去残余物质。

2.3 RGD 化水凝胶

①一定浓度（1 mg/mL）的BP-RGD 均匀滴在载玻片上，无SWNTs 层水凝胶向下，轻放到载玻片上。②从载玻片底面紫外（365 nm）照射30 min，使其充分聚合。③制备完成的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 双层水凝胶在PBS 中清洗2 h，除去未反应的BP-RGD。

2.4 光照实验

2.4.1 SWNTs 吸光性实验 室温下，将1.5 mg/mL SWNTs 放置在试管中，用波长为808 nm 的近红外激光均匀照射SWNTs 水溶液，水凝胶与光源距离为30 cm，光源功率为1 W，间隔3 min 测量样品温度。对照组为水溶液。

2.4.2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶光敏实验 室温下，将SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶放置在载玻片上，用近红外激光照射水凝胶，测量在照射0、15、30 min 时水凝胶体积，然后将水凝胶放置在冷水中15 min 并测量体积。对照组为无近红外激光照射的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶。

2.4.3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶光刺激可逆形变实验 室温下，将SWNTs/PNIPAMPNIPAM/RGD 水凝胶放置在载玻片上，用近红外激光照射水凝胶，测量在照射30 min 时水凝胶体积，然后将水凝胶放置在冷水中15 min 并测量体积，重复10 次。对照组为无近红外激光照射的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶。

3 结果

3.1 SWNTs 光热能量转换分析

本文使用的PNIPAM 是一种典型的温敏性水凝胶，在低温条件下，PNIPAM 在水中具有较高的溶胀度，体积增大；当温度升高，超过其相转变温度时，PNIPAM 水凝胶溶胀度降低，体积收缩。从图1 中可以看到，SWNTs 吸收近红外光的能量，转换成热量，使溶液的温度随光照射时间的增加而升高，15 min 时达到39℃，之后变化不明显。从图中可以明显的看到，SWNTs 吸收近红外光的能量可以达到水凝胶的相转变温度，实现水凝胶的形变。

图1 不同近红外光照时间下SWNTs 水溶液的温度曲线

3.2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶光敏性分析

通过图2 可以发现复合水凝胶在近红外激光的照射下，随时间的延长，体积发生了明显的变化，在30 min 时水凝胶体积减小近20%；之后将变形水凝胶放入冷水中15 min，水凝胶体积恢复。这是因为当近红外激光照射水双层凝胶时，SWNTs 吸收了近红外光的能量，进行光热转换，使水凝胶温度超过了其相变温度，导致含SWNTs层水凝胶发生相体积的变化，从而使双层水凝胶发生体积变化；当形变水凝胶放入冷水时，水凝胶温度低于其相变温度，变形水凝胶溶胀度增加，恢复形状。

图2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶光刺激响应曲线

3.3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶光刺激可逆性分析

根据光热能量转换和温敏性水凝胶相体积转变机理，在近红外光均匀照射在碳纳米管层水凝胶时，温度升高，使水凝胶超过其相变温度，使碳纳米管层水凝胶产生内应力，产生形变，随后仅使用冷水即可恢复形状。通过图3 可知，进行10 次循环后，双层水凝胶体积的变化和恢复效果依然良好。

图3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝胶光刺激可逆曲线

4 结论

利用光热转换的基本原理，成功制备了一种光刺激响应型双层水凝胶，一层为SWNTs 水凝胶，一层为表面修饰RGD 水凝胶。通过碳纳米管层水凝胶对近红外光的吸收，实现了温度在双层水凝胶之间不均匀分布，进而诱发形变。在该试验中，材料的形变仅通过冷水就可恢复到原始状态。因此，可以通过调节SWNTs 的浓度和光强度实现对水凝胶的不同频率、不同变形程度的调控，进而控制用于培养干细胞的RGD 水凝胶层，实现对干细胞分化的体外调控，最终实现将携带已分化的干细胞水凝胶层用于皮肤、软骨、肌肉等组织的修复。