鸡胸腺组织中免疫相关circRNA鉴定

刘 锐，李江凌，杜华锐,3，杨朝武,3，陈家磊，赵素君，王秋实

(1.四川省畜牧科学研究院，成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066；3.四川大恒家禽育种有限公司，成都 610066)

乌骨鸡作为食药同源珍禽广受消费者喜爱。四川独有的乌鸡品种——山地乌骨鸡具有“十全乌”特征[1]，且体型较大，其料重比、增重能力和屠宰性能均明显优于丝羽乌骨鸡[2]，具有较强的开发利用价值，但抗逆性差[3]、成活率较低[4]的缺点严重制约了山地乌骨鸡的推广应用。开展鸡抗病力研究不仅对优质鸡资源的推广十分重要，而且是当前家禽业集约化生产亟待解决的难题。对病原体的抵抗涉及免疫系统各个分支的动态合作，这使得识别抗病基因成为艰巨的任务，而开发环状RNA(circular RNA,circRNA)新功能为抗病力研究提供了新的解决方案。

circRNA是随着高通量测序技术发展而被重新认识的一类环状RNA分子，由于其表达的特异性和调控的复杂性，其在疾病发生中的重要作用越来越受到重视[5-6]。据报道，circRNA可从多个水平上调控基因表达，在许多生理和病理条件下是必不可少的[7]。Chen等[8]研究发现，外源circRNA能有效刺激天然免疫相关基因的表达，从而防止病毒感染。Li等[9]研究显示，细胞感染病毒后内源性circRNA表达减少，主要是由于circRNA和免疫因子形成circRNA-蛋白复合物(circRNA-protein complexes,circRNPs)来协调抗病毒免疫反应。circRNA在免疫系统中发挥着重要作用，但在家禽上相关报道较少。2020年，Liu等[10]在2和20 d鸡胚法氏囊中识别到13 689个circRNAs分子，其中27个circRNAs在两个不同发育阶段差异表达，表明circRNA在法氏囊中有丰富的表达，推测其对法氏囊的发育是必不可少的。

胸腺是鸡胚胎期最早发生的免疫器官，是T细胞发生、分化和成熟的场所[11]，在功能性免疫中发挥着至关重要的作用，因此，胸腺是基础免疫研究的良好模型。本研究以抗病力不同的黄羽肉鸡(大恒肉鸡)和山地乌骨鸡胸腺组织为试验材料，通过转录组测序筛选免疫相关的circRNA分子，探讨其在鸡免疫调节中可能的作用机制，以期为提高鸡抗病力研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于四川大恒家禽育种有限公司育种场随机选择相同环境下以相同条件饲养至10周龄的健康黄羽肉鸡(大恒优质肉鸡)和山地乌骨鸡公鸡各5只，屠宰后取胸腺组织并立即液氮冻存备用。共计获得10个鸡胸腺组织样品，黄羽肉鸡胸腺组织命名为RT,山地乌骨鸡胸腺组织命名为WT。

1.2 主要试剂及仪器

Trizol购自Invitrogen公司；反转录试剂盒(Perfect Real-time)购自TaKaRa公司；SYBR Green qPCR Mix(ROX)购自Roche公司。Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time购自ThermoFisher Scientific公司；NanoDrop ND-1000购自NanoDrop Technologies公司；Agilent2100购自Agilent Techno-logies公司；IlluminaHiseq购自Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 用Trizol法提取总RNA，按照试剂盒操作说明进行。用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染，用NanoDrop ND-1000测定总RNA的纯度和浓度，用Agilent 2100精确检测RNA完整性。

1.3.2 测序和数据质检 采用去除核糖体RNA的方法构建特异性文库，在Illumina PE150平台进行RNA-Seq测序。使用软件Hisat2将有效测序数据(clean reads)比对到基因组(Gallusgallus_Ensembl_97)，经比对和拼接后得到用于后续分析的转录本数据。

1.3.3 circRNA鉴定 用circRNA鉴定软件find_circ和CIRI对转录本数据进行circRNA识别，求取2个软件结果交集，参考基因组比对结果对其序列结构和分布进行统计分析，解析鸡胸腺circRNA基本特性。

1.3.4 circRNA表达差异及功能富集分析 用readcount统计circRNA的表达水平，并进行TPM(Transcripts Per kilobase Million)标准化处理。用DESeq2进行表达水平差异显著性分析，对差异显著circRNA的来源基因进行GO功能和KEGG通路富集分析以完成差异circRNA的功能注释，从而筛选出与免疫相关的circRNA。

1.3.5 circRNA编码潜能预测 利用IRESfinder软件识别circRNA序列的内部核糖体进入位点(IRES)，分值>0.5具有IRES元件，分值越高，准确度越高。利用PFAM软件识别circRNA序列的蛋白结构域，综合2个软件分析结果判定circRNA是否具有编码潜能。

1.3.6 实时荧光定量PCR 利用Primer Express设计引物，注意反向引物设计应当先将circRNA序列3′-端约150 bp截取置于5′-端，将设计的引物与NCBI Primer-blast上的序列进行比对，确保特异性，引物信息见表1。利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，在Applied Biosystems 7500 Fast Real-time上用SYBR Green qPCR Mix对部分circRNA进行实时荧光定量PCR，用于验证测序获得的基因表达水平。每个样品设3个重复。PCR反应体系15 μL：SYBR Green qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 6.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，61 ℃ 退火延伸1 min，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.4 统计分析

用基于负二项分布的DESeq2进行样品表达差异显著性分析，显著性检验的参数阈值设置为：log2|FoldChange|>1，P<0.05，即筛选表达量2倍以上的差异circRNA。

2 结 果

2.1 测序数据统计结果

由表2可知，10个胸腺组织circRNA测序共获得0.9×109条clean reads，各样本分别有92.63%～94.64% reads可比对到参考基因组，共约为0.85 G(93.70%)reads，平均每个样本reads数为84.99 M，说明测序数据经过过滤、测序错误率检查等可满足后续分析。

2.2 circRNA鉴定

用生物信息学软件find_circ和CIRI共识别到8 015个circRNAs。与参考基因组的比对注释发现，circRNA在鸡染色体上分布广泛但不均匀，在前10对大型染色体上数量相对较多，而微小染色体上数量则较少，性染色体Z上共鉴定到369个circRNAs，甚至超出部分常染色体(表3)，说明circRNAs的数目和染色体的长度有一定的相关性。

统计显示,鸡胸腺circRNA的长度在300 bp左右(中位数297)，最长的超过800 bp，circRNA的长度呈现正态分布(图1)。序列结构显示circRNA主要由外显子组成(图2)。

根据与参考基因组的比对结果，有550个(6.9%) circRNAs没有发现相应的来源基因，其他的circRNAs定位到基因组上2 663个基因中，其中大部分基因(1 357个，50.96%)产生1个circRNA；其他多数基因则产生2～4个circRNAs(图3)，说明只有1个亚型的circRNA在胸腺组织中占优势。

图1 circRNA长度分布
Fig.1 Length of circRNA

图2 circRNA结构组成Fig.2 Structure component of circRNA

图3 circRNAs来源基因分布Fig.3 Distribution of circRNAs among genes

2.3 circRNA表达差异分析

采用DEseq2进行circRNA表达差异分析，结果显示，在2个品种间差异表达(differential expression，DE)的circRNAs有115个(1.43%，115/8015)，其中54个在黄羽肉鸡中表达上调，61个表达下调(以山地乌骨鸡为对照，图4)。两品种间差异比较P值最小的是circ_0002478，其次是circ_0004186，分别是黄羽肉鸡中上调和下调表达的差异水平最显著的2个位点。这2个circRNAs来源于白介素受体1(IL-1R1)和N-myc下游调控基因3(NDRG3)，前者是细胞因子引起的免疫和炎症反应的重要介质；后者编码的蛋白与细胞凋亡、自噬及信号转导相关，在许多肿瘤细胞中可以促进肿瘤细胞的生存和发展，均参与免疫系统调节。

图4 两鸡种间差异表达circRNAs火山图Fig.4 Volcano plot of differentially expressed circRNAs between two breeds

2.4 差异表达circRNA功能分析

利用GOseq软件对DE circRNA来源基因进行了GO功能富集分析，共得到104个免疫相关GO条目，前10个见图5，所有免疫相关GO条目都是属于生物过程(biological process)类型，主要涉及细胞因子调控(positive regulation of response to cytokine stimulus,regulation of response to cytokine stimulus)、免疫细胞分化(T-helper 1 cell differentiation,CD4-positive,alpha-beta T cell differentiation)、激活(CD4-positive,alpha-beta T cell activation)以及免疫信号通路调控(regulation of cytokine-mediated signaling pathway,positive regulation of cytokine-mediated signaling pathway)。

104个免疫相关GO条目中富集了21个来源基因，很多来源基因在不同的GO条目中重复出现。21个来源基因共产生23个DE circRNAs，其中12个在黄羽肉鸡中表达上调，11个表达下调(表4)。21个来源基因主要在免疫反应过程、免疫信号通路传导、免疫调节中发挥重要作用。大部分基因只检测到1个差异表达的circRNA，只有淋巴增强子结合因子(LEF1)和细胞质分裂付出蛋白1(DOCK1)有2个差异circRNAs，来源于LEF1基因的2个cricRNAs表达均上调，而来源于DOCK1基因的2个circRNAs表达均下调。

KEGG通路分析结果显示，来源基因主要参与细胞因子-细胞因子受体互作、FoxO信号通路、NOD样受体信号通路、TLR样受体信号通路等生物学通路，其中与免疫相关的通路有7个，共富集了7个来源基因，涉及7个DE circRNAs,其中在黄羽肉鸡中有3个表达上调，4个表达下调(表5)。

由表4、5可知，GO功能和KEGG通路富集分析筛选出来的与免疫相关的来源基因中有5个是相同的，分别是MAPK11、IL-1R1、STX8、RIPK2和BRAF，其中来源于STX8和BRAF的circRNA在黄羽肉鸡中表达上调(circ_0001674、circ_0003590)，其余均表达下调。STX8通过囊泡融合和胞吐参与蛋白运输；BRAF通过免疫相关信号通路影响细胞分裂、分化和分泌；MAPK11和RIPK2与细胞活动有关，MAPK11基因调节细胞增殖、分化和发育；RIPK2影响细胞凋亡；IL-1R1在细胞因子活动中提供介质，这5个基因分别参与体液免疫和细胞免疫，相应的5个circRNAs可能在鸡胸腺免疫调节中发挥重要作用。

图5 差异circRNA来源基因GO功能富集(前10)Fig.5 Go function enrichment of source genes from differentially expressed circRNA (top 10)

表4 免疫相关GO功能富集的基因及其circRNA

表5 免疫相关KEGG通路中富集的来源基因及其circRNA

2.5 编码潜能预测

从表6可知，在GO功能和KEGG通路富集分析中共有14个circRNAs具有IRES元件，其中有编码潜能的有7个，而这7个circRNAs中只有来源于IL-1R1基因的circ_0002478在GO功能和KEGG通路中重复出现。

表6 免疫相关circRNA编码潜能预测

2.6 实时荧光定量PCR验证

为了验证测序数据的准确性，采用实时荧光定量PCR对鉴定到的circRNAs的表达水平进行检测，结果见图6。由图6可知，经测序数据识别的circRNAs可用实时荧光定量PCR技术检测，其中circ_0002478、circ_0003208和circ_0005105在黄羽肉鸡中的表达量极显著或显著低于山地乌骨鸡(P<0.01；P<0.05)；而circ_0001674和circ_0003590在黄羽肉鸡中的表达量极显著高于山地乌骨鸡(P<0.01)，这5个差异表达的circRNAs在2个鸡品种中差异趋势同测序结果是一致的。

*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)*，Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)图6 差异表达circRNAs实时荧光定量PCR验证Fig.6 Real-time quantitative PCR verification of differentially-expressed circRNAs

3 讨 论

目前，全球肉类消费已转向家禽，根据FAO统计数据，2020年禽肉占全球肉类蛋白总量的39.5%，超过猪肉(32.5%)、牛肉(21.2%)和羊肉(4.8%)，位居第一。中国受消费习惯和文化的影响，猪肉一直作为肉类蛋白的主要来源，但近两年在非洲猪瘟的影响下，鸡肉消费需求增长明显。但禽业发展面临着诸多挑战，如疾病风险、食品安全、动物福利等，特别是消费者关注的抗生素和药物残留直接影响生物安全和食品安全。培育出满足市场需求的品种，提高动物的抗病力，完善生物安全体系，才能推动家禽产业的持续健康发展。

circRNA分子的发现更新了RNA领域的研究深度，其广泛性、保守性、特异性和稳定性预示着它在许多生物学过程中发挥作用。近几年研究发现，circRNA分子可参与来源基因顺式调控[12]、与miRNA(microRNA,微小RNA)分子结合发挥海绵作用[13]及与蛋白结合形成功能复合物[9]，是基因表达调控中的重要因子。随着研究的深入，circRNA功能将进一步被揭示，特别是circRNA与免疫系统的互作。Liu等[14]研究发现，circRNA通过结合双链RNA依赖的蛋白质激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)调控先天性免疫，致病性双链RNA激活RNA酶L(RNase L)可降解circRNA从而释放PKR，发挥抗病毒作用，在先天性免疫缺陷的患者中circRNA数量锐减且PKR活性异常，相同序列的circRNA和线性RNA相比，circRNA与PKR的结合强度要高很多，证实circRNA在先天性免疫中的重要性。Li等[9]认为，circRNA能调节病毒感染后的免疫反应，因为细胞感染病毒后内源性circRNA数量减少。Chen等[8]用外源circRNA转染细胞后，先天性免疫调节因子和细胞因子被强烈诱导，细胞产生明显的免疫反应信号，且这种反应比同一序列的线性RNA转染细胞时更强烈。以上研究表明，circRNA可影响免疫系统调节。

本研究利用RNA-Seq技术在胸腺这个鸡最早发育的免疫器官中鉴定到对鸡免疫力有影响的circRNA分子。黄羽肉鸡(大恒肉鸡)是经过多年选育的培育品种，聚合了地方鸡优良基因，抗病力强，其10周龄成活率超过98%[15]，而山地乌骨鸡是自然选育形成的，未经过目的明确的人工选择，抗病力较差，其10周龄成活率低于80%[3]，二者差异明显。RNA-Seq数据显示，2个品种间有115个差异表达circRNAs。通过GO功能注释筛选出免疫相关GO条目104个，共富集了21个基因，表明许多基因有相同或相似的免疫调节功能。这21个基因产生的circRNAs中有23个在2个品种间差异表达。在所有的DE cricRNA中免疫相关cricRNA占比高达20%(23/115),说明了circRNA对机体免疫体系是必不可少的。KEGG通路分析发现有7个基因在免疫相关的通路富集，这些通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、FoxO信号通路，Toll样受体信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路和囊泡转运中SNARE蛋白互作等。免疫相关通路涉及7个DE circRNAs，其中有5个circRNAs与GO功能注释中DE circRNA相同，分别是circ_0002478(IL-1R1)、circ_0003208(MAPK11)、circ_0001674(STX8)、circ_0005105(RIPK2)及circ_0003590(BRAF)，推测它们可能在免疫系统调节中扮演着重要角色。

值得注意的是，在25个免疫相关circRNAs中circ_0002478(IL-1R1)在两品种间差异极显著，可能通过细胞因子-细胞因子受体通路参与免疫和炎症反应。在Guo等[16]构建的鸡应激诱导免疫抑制模型中细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路被高度激活，说明该通路对于免疫反应调节十分重要。Neyt等[17]研究发现，缺乏IL-1R1的小鼠病毒清除延迟，病毒复制时间延长，导致疾病严重程度增加。因此，circ_0002478(IL-1R1)的存在对于应对病毒或炎症反应可能是必需的。

circRNA早期被认为是异常剪接产物，多年后在人和动植物组织中发现数百个circRNAs时，其生物学功能才被重视。circRNA作为miRNA海绵或与来源基因mRNA竞争参与基因表达调控已被证明，但关于circRNA翻译成蛋白并发挥生物学功能的机制引起了热烈的讨论[18-20]。Wesselhoeft等[21]用生物工程技术合成外源性circRNA并使其在细胞中稳定表达蛋白；Costello等[22]使用结构化内含子表达载体在活的哺乳动物细胞中从质粒DNA(pDNA)中稳定地产生circRNA,并通过滚环翻译产生大量分泌蛋白。Zhang等[23]鉴定了1个由circRNA编码的87个氨基酸的肽PINT87aa，在功能上，PINT87aa而非其相应的circRNA部分控制癌细胞的细胞增殖和肿瘤发生。以上研究表明，circRNA能够编码蛋白，且在其翻译的肽的生物学意义和对疾病生理的影响方面潜力巨大。本研究对筛选出的与免疫相关的circRNA进行了编码潜能预测，有7个circRNAs具有IRES位点和蛋白域，其中circ_0002478(IL-1R1)在功能注释和通路分析中重复出现，说明circ_0002478(IL-1R1)在免疫调节中发挥重要作用，且可能以多种方式发挥功能，如与IL-1R1竞争从而调节免疫反应，或者翻译成多肽调节炎症反应，具体作用机制尚需进一步研究。

4 结 论

本研究采用高通量测序揭示了鸡胸腺组织circRNA表达特征，差异分析结果显示鸡胸腺组织有丰富的circRNA，且circRNA对机体免疫调节是必不可少的，在筛选出的5个与免疫相关的circRNAs(circ_0002478(IL-1R1)、circ_0003208(MAPK11)、circ_0001674(STX8)、circ_0005105(RIPK2)和circ_0003590(BRAF))中，circ_0002478(IL-1R1)可能通过多种方式参与免疫调节，可作为鸡免疫力研究的重点关注靶点。