JAK/STAT信号通路在肠黏膜再生及调节辅助性T细胞应答中的研究进展

昝庚秀，秦颖超，朱 超，王修启

(1.华南农业大学动物科学学院，广州 510642;2.广东省动物营养调控重点实验室,广州 510642;3.国家生猪种业工程技术研究中心,广州 510642)

肠道不仅是营养物质消化吸收的主要部位，也是重要的免疫和内分泌器官。维持肠黏膜形态结构和功能的完整对保障机体健康、提高养分转化效率、降低动物死淘率具有重要意义[1]。肠道黏膜上皮具有很强的代谢能力，其不断更新的动力来自隐窝基底部肠道干细胞(intestinal stem cell，ISCs)正常的增殖和分化[2]。隐窝中与ISCs相邻的潘氏细胞(Paneth cells，PCs)及其周边的肠间充质细胞(intestinal stromal cells)、肠上皮下成纤维细胞(intestinal subepithelial myofibroblasts，ISEMFs)和免疫细胞等组成ISCs生活的微环境(ISC巢)。其中，PCs、肠间充质细胞和ISEMFs主要依赖Wnt、BMP、Notch等信号分子调控ISCs活性。Herrera等[3]发现，肠道免疫细胞，尤其是辅助型T细胞(Th细胞)，能响应肠腔中有益或有害刺激因子，通过分泌表皮生长因子、白细胞介素(interleukins，ILs)和干扰素(interferons，IFNs)等生长因子和/或细胞因子，结合酪氨酸激酶相关受体，激活JAK/STAT信号通路，促进ISCs分裂，抑制其失巢凋亡，加快隐窝再生和绒毛重建。相反，JAK/STAT失活将导致ISCs不断丢失，肠细胞分化异常，隐窝消失，绒毛萎缩，肠道发育严重受阻[4]。目前，大多数研究聚焦于JAK/STAT信号通路在肠黏膜再生中作用，而关于其调节不同类型的免疫细胞与ISCs互作的研究相对较少，尤其是JAK/STAT在畜禽肠道免疫性疾病发生和发展过程中的重要性未被充分认识。探讨JAK/STAT信号通路在肠黏膜再生和免疫应答中的作用机制，有助于剖析肠道疾病的发生和发展过程，为开发稳态和应激状态下肠道健康调控剂提供依据。

1 JAK/STAT信号通路

1.1 JAK/STAT信号级联反应

JAK/STAT信号通路构成相对简单，主要由酪氨酸激酶相关受体、传递信号的酪氨酸激酶JAK和产生效应的转录因子STAT组成。其信号传递过程如下：细胞外信号因子结合膜上相应受体，诱导其发生二聚化；受体募集和藕联JAK，促使后者活化；激活的JAK以正反馈的方式磷酸化受体的酪氨酸残基，在受体上形成停泊位点，招募并磷酸化STAT；磷酸化的STAT从受体链上解离，形成二聚体后转移至细胞核并结合启动子，从而激活下游基因转录(图1)[5-6]。

1.1.1 JAK蛋白家族 JAK属于非受体型激酶，包括JAK1～JAK3和酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2，TYK2)4个成员，其中JAK1、JAK2和TYK2在肠道表达。JAK蛋白家族成员有7个JAK同源结构域(JAK homology domain，JH)。其中C-末端JH1、JH2结构域分别为激酶区和“假”激酶区，具有催化功能；N-末端的4个JH是受体结合区域[7-8]。生理条件下，细胞因子与其特定的细胞表面受体结合，受体构象发生改变，活化其胞内段的JAK结合位点，随后招募JAK激酶并使其磷酸化。多数受体由1条或2条配体特异链和共用亚基组成。根据共用亚基的不同可将受体分为以下3种：①gp130型，是IL-6、IL-11、IL-12、IL-23、IL-27和IL-35受体，能激活JAK1、JAK2、JAK3和TYK2[9-10]；②βc型，是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、IL-3和IL-5的受体，激活JAK2[11-13]；③γc型，是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13，IL-15和IL-21的受体，激活JAK1和JAK3[14-16]。此外，IFN受体家族，包括IFNs(α、β和γ)和ILs(10、19、20、22、24和26)通过JAK1、JAK2和TYK2传导信号[17-19]。

1.1.2 转录因子STAT STAT是一类转录因子，有STAT1～STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6共7个成员。STAT蛋白由3个结构域、2个激活域和1个DNA结合域组成[20]。氨基末段结构域不仅是活化的STAT形成二聚体的结构基础，也是STAT与启动子结合的结构基础；卷曲螺旋结构域的亲水性表面能与调节因子结合，调控STAT活性；Src同源2区(Src homology 2 domain，SH2)结构域是其与受体磷酸化的特异性结合区，如IL-4和IL-12分别特异性激活STAT6和STAT4[21]；酪氨酸激活域与Src同源2区结构域相邻，防止STAT蛋白自身磷酸化；转录激活域由C-末端残基组成，感应不同的转录调节；DNA结合域是其与增强子γ活化位点(gamma activated site，GAS)家族结合部位[22]。

1.2 JAK/STAT信号负调节因子

活化的STATs移位至细胞核，与启动子结合后启动靶基因转录，随后STATs失活，重新回到细胞质中。这种快速的失活机制主要依赖于细胞因子信号转导抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)、蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)和活化STATs蛋白抑制因子(protein inhibitors of activated stats，PIAS)[23]。

1.2.1 SOCS家族 SOCS家族成员由SOCS1～SOCS7和细胞因子诱导的含SH2结构域蛋白(cytokine inducible SH2 containing protein，CIS)组成[24]。活化的STATs促进SOCS基因转录，SOCS蛋白与受体竞争性结合磷酸化的JAKs，抑制STATs的活化。通过体外激酶测定系统分析发现，SOCS3疏水性表面能特异性结合到JAK2催化结构域JH1，从而阻断底物和JAK2结合，抑制JAK2的活化[23]。研究表明，CIS1基因过表达或STAT5缺陷都会导致小鼠IL-2信号级联缺陷[25]。进一步的证据显示CIS1与STAT5可形成负反馈环，即CIS1基因转录依赖于STAT5，翻译后的CIS1又反过来抑制STAT5的活性[26]。

1.2.2 PTPs家族 PTPs家族成员包括SHP1、SHP2和T细胞PTP等。其中关于SHP2的研究最多。SHP2含有N-SH2和C-SH2 2个串联结构域，可调节自身和磷酸化酪氨酸残基上的信号分子的相互作用，以及C-末端具有Tyr542和Tyr580磷酸化位点的酪氨酸磷酸酶域，促进SHP2对信号分子的识别，后者能够磷酸化[27]。SHP2阻断STAT1、STAT5磷酸化或加速其脱磷酸化，下调JAK/STAT信号活性[28-29]。

1.2.3 PIAS家族 PIAS家族成员包括PIAS1、PIAS3、PIASx(PIASx A和PIASx B)和PIASy。与SOCS家族作用机制不同，PIAS蛋白存在于胞质中，阻碍STATs单体二聚化，阻断JAK/STAT信号转导[30]。 目前已知PIAS1和PIAS3分别特异性抑制STAT1和STAT3的活性[31-32]。胞外细胞因子水平和胞内负调节因子家族的活性变化可适当激活或抑制不同的JAK/STAT磷酸化水平，以及下游靶基因丰度，控制细胞命运，从而保持肠道平衡状态，维护肠道正常功能，调控肠道发育进程。

2 JAK/STAT调控ISCs增殖、凋亡和分化命运

ISCs不断分裂生成新的肠道干细胞或其子代细胞——短暂扩增细胞，短暂扩增细胞在离开隐窝底部后不断增殖并分化为各类成熟肠上皮细胞，这些细胞向肠绒毛顶端主动迁移，补充绒毛顶端凋亡脱落的肠上皮细胞[33]。研究表明，JAK/STAT通路的自主激活足以诱导ISCs增殖和肠道更新，这种快速应答对损伤条件下ISCs存活尤为重要[34]。此过程涉及到STAT靶基因survivin、pim1、c-Myc、细胞周期蛋白质cyclin、细胞分裂周期蛋白质25A(Cdc25A)、细胞外基质金属酶MMP和Bcl-2基因，它们参与调节细胞周期、凋亡和分化进程[35]。

稳态条件下，果蝇ISCs不对称分裂产生ISC和肠母细胞(EB)，肠母细胞退出细胞周期并直接分化为吸收性肠母细胞(EC)[36]。普遍的观点认为，Notch信号诱导EB向EC分化，因此，ISCs中Notch缺失引起由ISCs组成的肿瘤发生；而EB中JAK/STAT活性最高，缺乏Stat92E的EB不能分化为成熟的肠道细胞，致使由祖细胞组成的肿瘤的形成。尽管Notch和Stat92E是EB分化所必需的，但二者上下游关系尚不确定。Beebe等[37]研究发现，Stat92E突变导致的分化缺陷不能通过激活Notch来挽救，提示它们可能平行发挥作用。 然而Liu等[38]针对果蝇进行研究，结果显示激活Notch信号可以促进Stat92E突变体中的ISCs转化为肠上皮细胞。

当果蝇肠细胞在受到凋亡或感染等应激信号时，会分泌Upd1、Upd2和Upd3，通过与膜受体结合，激活JAK/STAT信号，促进ISC的自我更新和分化[39]。同时，沉默型干细胞标记BMI1基因座可直接与STAT5结合，促进沉默型小肠干细胞向Lgr5+活跃型ISCs的转化。敲除STAT5后隐窝中增殖细胞数量显著减少；而重新导入STAT5则能恢复ISC活性，维持肠上皮正常形态[40-41]。

此外，IFN-γ和TNF-α能通过JAK/STAT1通路激活沉默型干细胞，促使其重新进入细胞周期，修复肠道损伤[42]。Lindemans等[43]发现，IL-22能够促进STAT3 Tyr705磷酸化，增加小鼠肠道类器官表面积，诱导肠干细胞向杯状细胞的分化。STAT3缺失会导致Caspase3活性增强，诱导细胞发生凋亡[44]。 相反，STAT3过表达增加CyclinD1的表达，促进细胞增殖。而生长激素(GH)和GM-CSF则通过激活STAT5提高炎症状态下肠上皮细胞活力[45-46]。

JAK/STAT介导的肠道稳态和损伤后修复的焦点在于ISC的增殖、凋亡和分化活性，驱动ISC再生，维持隐窝绒毛轴正常形态结构和上皮屏障功能，促进肠细胞对营养物质吸收，是保障动物肠道健康的关键。

3 JAK/STAT信号通路调控肠道屏障功能

肠道屏障，包括微生物屏障、免疫屏障和机械屏障，是机体抵御外源病原微生物和毒素攻击的主要防线，其中机械屏障最为重要，它能选择性地允许肠腔内某些物质进入机体内环境[47]。肠道受损后，经免疫系统活化诱导产生的ILs等细胞因子不但参与T细胞和B细胞的活性调节，还可通过JAK/STAT信号通路控制肠上皮细胞凋亡进程，减少各种外界损伤引起的细胞凋亡。王瑞娟等[48]发现，IL-11预处理激活JAK/STAT信号通路，增加增殖细胞核抗原阳性细胞数量，缓解放化疗造成的小鼠肠道损伤。IL-22提高抗凋亡基因(BIRC5、pla2g5)和促增殖基因(MO、MYC和MCL1)的转录，对促进组织修复有明显效果[49]。此外，IL-22还可上调小鼠结肠及Caco-2细胞Claudin-2的表达，从而增加肠上皮屏障功能[50]。作者所在研究团队2020年的研究结果表明，在断奶仔猪饲粮中添加谷氨酸可上调JAK2/STAT3信号通路活性，而通过染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)发现，p-STATs可以结合Occludin和ZO-1基因的启动子区域，调节Occludin和ZO-1的表达，增强肠道机械屏障功能[51-53]。

4 JAK/STAT信号通路与Th细胞平衡

肠道免疫细胞保持着高度的免疫应答，以快速清除肠腔中的病原菌。Th细胞主要包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)，对维持肠道免疫屏障至关重要。正常生理状态下，Th1/Th2细胞和Th17/Treg分别两两相互颉颃，保持动态平衡。Th1/Th2或Th17/Treg的平衡被打破都会导致肠道慢性炎症[54-55]。

特异性STAT激活是Th细胞命运决定的关键事件。STAT1和STAT6分别是Th1和Th2的特异性转录因子[56-57]，其中，Th2细胞是清除寄生虫(尤其是蠕虫)的主要免疫细胞，可通过产生IL-4、IL-5和IL-13(刺激B细胞产生IgE)参与机体过敏反应[58]；STAT3能促进Th17特异性转录因子视黄酸受体相关的孤儿核受体γ的表达，增加IL-17的分泌，促进中性粒细胞的富集，减弱致病真菌的定植能力，降低肠道感染风险[59]。同样有研究者发现，降低JAK2/STAT3信号活性，可抑制Th17成熟与分化，缓解黏膜炎症引起的免疫失调和紊乱[60]。视黄酸(维生素A的代谢产物)能增强STAT5的表达，后者与Treg特异性转录因子FoxP3基因启动子结合以促进Treg分化，抑制其他Th细胞过度活化，维持免疫耐受[61-62]。这些结果说明STAT信号是控制机体肠道免疫机能的开关。

体外研究发现，多种Th细胞及其产生的细胞因子能与膜上MHCⅡ结合，调节ISCs扩增[63]。Th1细胞分泌的IFNγ可能促进ISCs分化为潘氏细胞[64]；也可直接作用于细胞膜表面受体IFN-γR，激活JAK/STAT信号通路，启动包括趋化因子、抗原呈递分子和各种具有抗菌抗病毒效应的细胞因子的表达[65]。Th1和Th17与小肠类器官共培养可抑制Lgr5+干细胞发育为类器官，它们各自分泌的IL-1和IL-17均具有降低Lgr5+干细胞活性的作用,而Th2的分化水平对维持干细胞的活性具有重要意义[66]。Treg与小肠类器官共培养增强Lgr5+干细胞的活性，小肠中的Treg敲除引起Lgr5+细胞的丢失[67]。以上这些研究证实Th细胞能调节JAK/STAT信号，影响干细胞的增殖和分化命运(图2)[68]。

图2 JAK/STAT信号通路与Th细胞的相互作用[68]Fig.2 JAK/STAT signaling pathway interacts with Th cells[68]

5 JAK/STAT信号通路与畜禽肠道疾病

JAK/STAT信号通路与肠道黏膜免疫疾病的发生和发展密切相关。研究表明，当机体被感染时，受攻击的细胞会分泌干扰素，与干扰素受体结合，激活JAK/STAT信号通路；该通路的关键靶蛋白STAT被激活后，与特定的干扰素家族成员一起组成干扰素基因复合物，后移位至细胞核，诱导干扰素刺激基因的表达，启动自身免疫；而抑制干扰素介导的免疫途径，机体则无法建立有效的抗病毒屏障[69]。然而，某些病毒，如非洲猪瘟病毒则通过抑制STAT1和STAT2蛋白表达，阻断干扰素信号通路，完成免疫逃逸过程[70]。这可能是非洲猪瘟病毒侵入机体后，诱导肠黏膜出现典型出血症状的原因。同样，猪三角洲病毒依赖自身NSP5结构域，特异性抑制STAT2，是其躲避机体免疫、破坏肠道结构、引起腹泻的主要途径[71]。Li等[72]和Zhao等[73]在猪小肠上皮细胞模型上发现，IFN-λ3比INFα具有更好的抗病毒能力，原因在于其对激活JAK/STAT信号通路具有更强的刺激作用。然而，过度激活的JAK/STAT信号通路也是诱发畜禽肠道疾病的重要原因，如猪传染性胃肠炎，猪流行性腹泻病毒和鸡产气荚膜梭菌感染引起的肠道炎症等[74-77]。因此，关注JAK/STAT信号通路对保护畜禽肠道健康具有重大意义，而如何合理干预JAK/STAT信号通路，可能成为生产中防治畜禽肠道疾病的新途径。

6 小 结

JAK/STAT信号通路介导ISC驱动的肠上皮更新和再生及Th细胞参与的肠道炎症的发生和发展，以维持肠道功能的正常运转。 然而，调控该过程的直接靶点在很大程度上尚不清楚；且以JAK/STAT为核心构筑的复杂信号网络系统尚未被完全解析。大量研究表明，功能性营养素具有促进肠道损伤后修复的功能，但大多缺乏足够证据证实营养素促进肠道修复是通过JAK/STAT信号通路实现的。未来的研究应侧重于如何精确调控JAK/STAT途径更好地维持肠道内环境的稳定及其与其他信号通路的相互联系，并借助肠道类器官模型和基因编辑技术筛选确定JAK/STAT相关的肠道疾病中的干预靶标，为畜禽养殖过程中开发新的功能性饲料添加剂，以及调控畜禽肠道健康、减轻肠道疾病提供理论依据。