牛病毒性腹泻病毒E0-E2基因融合腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价

任 杰，林 泠，汤德元，曾智勇，王 彬，禹光美，郑如雯，吴道义，黄 涛

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.毕节市畜牧兽医科学研究所，毕节 551700)

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的牛的一种病毒性传染病，于1946年在纽约首次发现[1]。现代养牛业的集约化、规模化养殖及新品种的引进导致该病的发病率逐渐增加，目前该病已广泛流行于全世界。据统计，发生该病的动物病死率可高达35%，给养牛业带来了严重的经济损失[2-3]。当前防控该病最有效的措施仍是疫苗免疫，而在售的商品疫苗主要有减毒疫苗和灭活疫苗，由于传统疫苗的局限性导致该病免疫失败率较高，结果尚不理想，使研究针对该病新的高效疫苗成为了当前亟需解决的问题[4]。

研究表明，腺病毒载体疫苗可携带具有保护性抗原的基因，使相应宿主产生特异的免疫反应，但又不整合到宿主基因、无需佐剂，并能有效刺激机体产生强烈的体液及细胞免疫反应[5-7]，为BVDV基因工程疫苗的研究指引了一个新的方向。1999年，Elahi等[8]利用BVDV C蛋白基因构建重组腺病毒，将其免疫小鼠后能产生特异性免疫反应，但后续并未对C蛋白基因做进一步深入研究，国内也鲜见BVDV腺病毒载体疫苗相关报道。E0、E2基因是BVDV的囊膜糖蛋白和保护性抗原控制基因，其中E0基因具有高度保守性，在病毒正常生理活性方面发挥重要作用，而E2基因则具有保守的糖基化位点，是BVDV的主要保护性抗原蛋白和主要抗原区域与宿主细胞识别、吸附的重要部位[7-8]。与C蛋白相比，BVDV E0和E2蛋白研究更深入，且良好的抗原性也得到众多学者的认可[9-10]。本研究结合腺病毒载体疫苗的优势及E0和E2蛋白良好的抗原性及高度保守性，以人腺病毒5型为载体将BVDVE0及E2基因融合后构建重组腺病毒Ad5-E0-E2，并对其免疫效果进行综合评估，旨在为BVDV的疫苗研制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、细胞及菌株 BVDVE0、E2基因克隆质粒均由贵州大学临床兽医学实验室保存；人5型腺病毒穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP、AdMax腺病毒系统均购自北京擎科生物科技有限公司；低代次人胚肾细胞系HEK293T细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；大肠杆菌Top10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 试验动物 6～8周龄SPF级体重18～20 g健康昆明小鼠各40只，雌雄各半(动物合格证书：No.110324210102606873),购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。文中所涉及的动物试验研究均已通过贵州大学实验动物伦理与福利委员会审查。

1.1.3 主要试剂 牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ、Tris、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、PVDF膜(0.45 μm、0.22 μm)25*15 cm均购自北京索莱宝科技有限公司；Hind Ⅲ、SalⅠ核酸内切酶均购自TaKaRa公司；牛BVDV阳性血清、辣根过氧化物酶(HRP)、山羊抗牛IgG (H+L)二抗，细胞培养板96孔标准型、T25细胞培养瓶均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；特超敏ECL化学发光试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)均购自上海碧云天生物技术有限公司；BVDV抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；Anti-Mouse CD3ε、Anti-Mouse CD4、Anti-Mouse CD8α流式抗体均购自联科生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的扩增 根据BVDVE0(GenBank登录号：EU709763)和BVDVE2(GenBank登录号：KX170165)基因序列设计扩增引物，其中BVDV E0-F、BVDV E2-R分别加入SalⅠ和HindⅢ酶切位点，引物序列见表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。以BVDVE0、E2基因组为模板,PCR扩增相应目的片段。PCR反应体系25 μL：2×PfuMasterMix(Dye) 12.5 μL，基因组模板2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收PCR产物。

表1 引物信息

1.2.2 重组穿梭载体构建与验证 以回收的E0、E2基因片段为模板，用引物E0-F和E2-R进行重叠延伸PCR，扩增反应条件同1.2.1，E0-E2融合基因片段预期扩增大小为1 819 bp。PCR产物回收后使用Hind Ⅲ、SalⅠ对E0-E2融合基因与pDC316-mCMV-EGFP进行双酶切后回收，运用T4 DNA连接酶将回收的E0-E2融合基因片段和pDC316-mCMV-EGFP载体线性化片段连接，并转化大肠杆菌Top10感受态细胞培养后，挑取阳性菌落转液体培养，后期提取质粒，经双酶切及测序进行鉴定。 将鉴定成功的穿梭质粒命名为pDC316-E0-E2。

1.2.3 重组腺病毒包装 将穿梭质粒pDC316-E0-E2与AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGlox(delta)E1，3Cre混匀后共转染至HEK293T细胞中，并于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中过夜培养，观察细胞生长形态直至出现细胞病变效应(CPE)，待一半细胞出现CPE后收存于2 mL冻存管中。-80和37 ℃水浴反复冻融3次，每次10 min,涡旋1 min，释放出腺病毒颗粒。4 ℃、12 000×g离心5 min，0.22 μm过滤收获上清液，验证腺病毒的包装。将获得的重组腺病毒命名为Ad5-E0-E2。

1.2.4 重组腺病毒Ad5-E0-E2表达鉴定 用重组腺病毒Ad5-E0-E2感染HEK293T细胞，待细胞产生大量CPE时收集细胞，使用裂解液使其裂解释放腺病毒。取上清液进行12% SDS-PAGE，分离蛋白。经转膜后用TBST配制好的5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，取膜用TBST洗涤3次,10 min/次；1∶1 000稀释的牛BVDV阳性血清作为一抗，4 ℃孵育过夜。取膜用TBST配制好的HRP标记的山羊抗牛IgG按1∶1 000稀释后作二抗，37 ℃孵育2 h。用ECL发光试剂盒进行显色曝光并拍照。

1.2.5 腺病毒滴度的测定 将纯化后的病毒液进行10倍倍比稀释，接种于96孔板中已培养至致密单层HEK293T细胞上，按照Reed-Muench法测定所分离病毒的滴度。

1.2.6 牛病毒性腹泻E0-E2基因重组腺病毒免疫原性评价 选取40只6～8周龄小鼠作为评价模型，分为4组，肌内注射、皮下注射PBS对照组和肌内注射、皮下注射Ad5-E0-E2试验组，记作1、2、3、4组,隔离饲养，每组10只，雌雄各半；按照表2免疫程序进行免疫，首免后7 d后进行二免，二免后7 d进行免疫原性检测。

1.2.7 BVDV抗体检测 待小鼠二免后7 d尾尖采血离心收集血清，采用BVDV抗体检测试剂盒按照使用说明书检测小鼠血清抗体水平。经酶标仪测定样品D450 nm值并计算S/P值。S/P>0.30判定为阳性，S/P<0.20判定为阴性。

1.2.8 T淋巴细胞亚群检测 小鼠经过首免和二免后尾尖采血收集于抗凝管中，按流式细胞仪使用步骤上机检测。比较分析重组腺病毒首免和二免小鼠后CD4+、CD8+含量及 CD4+/CD8+变化，分别于首免、二免后1周对小鼠尾尖采血于EDTA抗凝管中。运用反向加样法将50 μL抗凝全血加入流式试管中混匀。 取20 μL CD3+、CD4+、CD8+抗体加入试管中旋涡混匀，置于室温避光放置20 min。加入450 μL 1*FACS溶血素混匀室温放置10 min。再通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群。

1.2.9 数据统计分析 试验数据用SPSS 18.0软件进行分析。P<0.01表示差异极显著。

表2 小鼠免疫程序

2 结 果

2.1 目的基因扩增结果

以 BVDVE0、E2基因组为模板扩增BVDVE0、E2基因，PCR产物凝胶电泳结果显示，分别在约681及1 122 bp处出现2条目的条带(图1)，与预期相符。以E0、E2基因为模板，使用引物E0-F及E2-R进行重叠延伸PCR扩增，PCR产物电泳结果显示，得到大小约为1 819 bp的E0-E2融合基因(图2)，将所得产物经纯化回收并送测序分析，测序结果与预期E0-E2融合基因扩增大小结果一致。

M，DL2000 DNA Marker；1，E0基因；2，E2基因M，DL2000 DNA Marker；1，E0 gene；2，E2 gene图1 E0、E2基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of E0 and E2 genes

图2 E0-E2融合基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification result of E0-E2 fusion gene

2.2 重组穿梭载体构建与验证结果

用Hind Ⅲ、SalⅠ限制性内切酶对构建的pDC316-E0-E2进行双酶切，结果同时出现1 819及5 879 bp的2条目的条带(图3)。经测序分析，其结果与E0-E2融合基因及pDC316-mCMV-EGFP相符，表明穿梭质粒pDC316-E0-E2构建成功。

M1,DL15000 DNA Marker；1,pDC316-mCMV-EGFP；2,pDC316-E0-E2双酶切结果；M2,DL2000 DNA MarkerM1,DL15000 DNA Marker；1,pDC316-mCMV-EGFP；2,Double enzyme digestion results of pDC316-E0-E2；M2,DL2000 DNA Marker图3 pDC316-E0-E2酶切鉴定结果Fig.3 Identification results of pDC316-E0-E2 enzyme digestion

2.3 穿梭质粒与腺病毒共转染包装检测结果

将构建好的穿梭质粒pDC316-E0-E2与AdMax腺病毒系统骨架质粒混匀后转染HEK293T细胞，转染7～10 d后观察到细胞后产生串联、空泡、圆缩并脱离培养皿底壁等细胞病变，镜检细胞呈现绿色荧光与预期结果相符(图4)，证明重组腺病毒Ad5-E0-E2包装成功。

A,转染重组穿梭质粒的HEK293T细胞;B,HEK293T细胞对照A,HEK293T cells transfected with recombinant shuttle plasmid;B,HEK293T cell control图4 重组穿梭质粒pDC316-E0-E2在HEK293T细胞中转染情况(100×)Fig.4 Transfection of recombinant shuttle plasmid pDC316-E0-E2 in HEK293T cells (100×)

2.4 重组腺病毒表达蛋白Western blotting检测结果

Western blotting检测果显示，在约65 ku处出现特异性条带(图5)，说明重组病毒能正常表达目的蛋白，表达的蛋白具有良好的反应原性。

M，蛋白质分子质量标准；1～3，Ad5-E0-E2蛋白M，Protein Marker；1-3，Ad5-E0-E2 protein图5 重组腺病毒的Western blotting验证Fig.5 Western blotting verification of recombinant Adenovirus

2.5 腺病毒滴度测定结果

通过Reed-Muench法测定Ad5-E0-E2滴度为1.1×1010PFU/mL。

2.6 BVDV E0和E2基因重组疫苗免疫原性探究结果

2.6.1 BVDV抗体ELISA检测结果 试验组注射Ad5-E0-E2后 S/P值均>0.30,血清抗体水平为阳性，且肌内注射组S/P值高于皮下注射组。PBS对照组S/P值<0.20，为阴性(表3)。 说明注射Ad5-E0-E2后小鼠激发BVDV抗体产生特异性体液免疫反应。

表3 ELISA检测BVDV抗体S/P结果

2.6.2 T淋巴细胞亚群检测结果 首免后试验组CD4+水平均极显著高于PBS组(P<0.01)，二免后各组CD4+水平均有上升，但试验组仍极显著高于PBS对照组(P<0.01)，首免和二免后试验组CD8+水平均极显著低于PBS对照组(P<0.01)(表4)；首免和二免后试验组CD4+/CD8+比值均极显著高于PBS对照组(P<0.01)(表5)。 说明构建的重组腺病毒能刺激机体增加CD4+T淋巴细胞含量。

表4 全血T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+含量

表5 全血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的比值

3 讨 论

20世纪80年代至20世纪90年代，BVD在许多国家发生大规模感染，平均感染率可达60%以上[2-3]。近年来，国内学者对BVD的感染发病情况做了大量调查研究，2014年李智勇等[11]采用ELISA方法检测甘肃部分养殖场和屠宰场220份血清，BVDV抗体阳性率为56.36%；2016年曲萍等[12]对中国新疆、青海、宁夏、甘肃和四川的感染情况进行调查发现，BVD的平均感染率在60%以上；2017年陈新诺等[13]用PCR方法检测四川和西藏地区部分牧场149份临床症腹泻的牦牛粪便样品，抗原阳性率分别为12.66%和29.14%；2019年姚志兰等[14]检测江浙部分地区145份具有腹泻症状的犊奶牛血清，BVDV抗原阳性率为13.1%；2021年石柯等[15]运用PCR方法对贵州地区224份鼻拭子样品检测结果显示，36份为抗原阳性，阳性率为16.07%。以上调查结果均表明中国BVD的发病率较高，防控形势严峻。20世纪90年代中国也进行了BVDV疫苗的探索研究，但由于成本和成效等各方面的原因，目前尚无较高效和经济疫苗普遍投入使用。基于此，本研究利用腺病毒疫苗的高效性成功组装了BVDVE0、E2基因重组腺病毒疫苗，以期为BVDV疫苗研究提供依据。

陈文龙[10]研究表明，BVDV侵入动物机体后损伤宿主细胞的同时改变了宿主细胞的正常生理学功能，导致细胞受到损伤和持续性感染。感染型的BVDV能引起细胞的自吞噬及细胞中BVDV的囊膜蛋白E0、E2的表达量显著升高，结构蛋白E0和E2免疫原性好，刺激机体的体液和细胞免疫应答，产生有效的抗体[16-17]。因此，本试验在构建BVDV重组腺病毒疫苗时选用了E0、E2基因作为融合基因。孙凡婷[18]将优化的E0基因和截短的E2基因通过重叠延伸PCR融合，构建BVDV E0-E2融合基因重组卡介苗，获得的目的蛋白具有反应原性。马小静等[19]将BVDVE0基因和牛传染性鼻气管炎病(IBRV)gD基因连接到真核表达载体pVAXI-IRES中，构建pVAXI-E0-FIRES-gD重组真核表达载体,通过免疫荧光检测构建的基因能成功表达，表达的蛋白接种小鼠后能产生抗体。 梁霄勇[20]将BVDVE0基因插入到pVAX1真核表达载体，构建重组质粒pVAX1-E0，首次免疫后产生抗体，加强免疫后抗体水平随之增加。本研究对不同途径免疫动物抗体水平进行分析发现，肌内、皮下注射Ad5-E0-E2均能产生较高的抗体水平；T淋巴细胞亚群检测显示，肌内注射组和皮下注射Ad5-E0-E2组CD4+水平高于对照组，首免和二免CD4+/CD8+值均高于对照组，说明构建的重组腺病毒疫苗具有较好的免疫原性。本试验结果初步说明所构建的重组腺病毒Ad5-E0-E2具备BVDV疫苗毒株候选条件，其本体试验和攻毒试验还有待进一步研究。

4 结 论

本研究以人腺病毒5型为载体将BVDV E0及E2蛋白基因进行融合后构建重组腺病毒Ad5-E0-E2，且具有良好的反应原性和免疫原性，具备BVDV疫苗毒株的基本条件，可运用到本体动物进行试验研究。