BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

麻宝艺，盛陈艳，刘宏莹，马青霞，汪婷婷，李健明，时 坤，杜 锐,3,4，冷 雪

(1.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118;3.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春 130118；4.吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心，长春 130118)

牛病毒性腹泻(黏膜病)(bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的牛最常见的重要病毒性疾病之一[1]。1946年，美国首次发现BVD，之后相继在其他国家流行[2]。中国于1980年首次发现该病，并于1983年在胎牛血清中成功分离并鉴定出BVDV[3]。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报动物疫病，在各大洲处于流行阶段[4]。BVD广泛存在于世界范围内，其流行给养牛业的健康发展带来了极大的影响。

BVDV是一种小型的，有包膜的单股正链RNA病毒，约12.5 kb，是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员[5]。1994年，Ridpat等根据病毒基因组5′-非翻译区(5′-UTR)序列的区别，将BVDV分为1(BVDV1)和2(BVDV2)两种基因型[6]。近年来相继报道了另外1个基因型，其基因序列与已知BVDV1和BVDV2有较大的差异，被命名为“Ho-like”瘟病毒，也被称为BVDV 3型(BVDV3)[7]。中国分离鉴定的BVDV以BVDV1为主，但近年来出现了关于中国牛群感染BVDV2型的报道[8]。本研究根据BVDV1和BVDV2的5′-UTR区计特异性引物，构建基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR检测方法，用于BVDV1和BVDV2的鉴别检测，有助于发现不同时期某地区流行的BVDV的主要基因型，为预测BVDV的流行趋势及中国BVDV流行病学研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 毒株和临床样品

BVDV1和BVDV2标准阳性毒株、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis，IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)均由吉林农业大学经济动物疫病实验室保存。156份牛鼻拭子和粪拭子样品采自吉林省部分牛场。

1.2 主要试剂

病毒基因组提取试剂盒购自江苏康为世纪生物科技有限公司;PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 Plus Dye)、2×TaqMan Fast qPCR预混液、pMD19-T载体、DL5000 DNA Marker、琼脂糖、核酸染料、回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.3 引物与探针设计与合成

根据GenBank上收录的53株BVDV1和42株BVDV2的5′-UTR的保守序列设计2对实时荧光定量PCR引物和探针(表1)。引物和探针均由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 重组阳性质粒的制备

根据商品化RNA提取试剂盒说明书进行操作，从BVDV1和BVDV2标准阳性毒株中提取病毒RNA，反转录成cDNA进行普通PCR扩增。PCR反应体系25 μL：PremixTaqTM12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件：98 ℃变性10 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对鉴定正确的PCR产物进行切胶回收。目标片段与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行PCR和测序鉴定，获得BVDV1和BVDV2阳性质粒并进行测序。通过核酸测定仪来测定重组阳性质粒的浓度，使用样品拷贝数计算公式来换算阳性标准品的拷贝数。重组阳性质粒于-80 ℃保存备用。

表1 引物及探针序列

1.5 双重实时荧光定量PCR反应条件的优化

1.5.1 退火温度的优化 试验扩增程序中的退火温度设置为55.0、56.0、57.0、58.0、58.9和59.5 ℃ 6个温度，同时设立阴性对照，根据循环阈值(Ct值)和荧光强度综合判定最佳退火温度。

1.5.2 引物、探针浓度的优化 将引物和探针分别稀释为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L 5个不同浓度，进行双重实时荧光定量PCR。PCR反应体系20 μL：2×TaqMan Fast qPCR预混液10 μL，qPCR-BVDV1、qPCR-BVDV2引物和探针各1 μL，BVDV1和BVDV2重组阳性质粒混合模板2 μL，ddH2O 2 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，57 ℃ 40 s，共45个循环，同时设立阴性对照，根据Ct值和荧光强度综合判定最佳的引物和探针浓度。

1.6 标准曲线的建立

将BVDV1和BVDV2重组阳性质粒进行10倍倍比稀释，设置6个稀释梯度(103～108拷贝/μL)，将其作为反应模板，每个稀释度设3个重复，按照优化后的反应体系和条件进行实时荧光定量PCR扩增，生成Ct值，分析标准曲线结果。

1.7 特异性试验

为了排除BVDV标准阳性毒株与其他牛病毒病原体之间的交叉反应性，提取IBRV、BRSV和BPIV3的核酸，以BVDV1、BVDV2标准阳性毒株及IBRV、BRSV、BPIV3的DNA或cDNA作为模板，并设立阴性对照，进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。

1.8 敏感性试验

对重组阳性质粒进行10倍倍比稀释(100～108拷贝/μL)，确定该方法的最低检出限(LOD)，来评估TaqMan实时荧光定量PCR检测的灵敏度，同时与普通PCR进行灵敏度的比较。

1.9 重复性试验

为了检测TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的重复性，分别使用10倍倍比稀释的重组阳性质粒(103、105和107拷贝/μL)作为模板，将已经稀释好的6组不同浓度重组阳性质粒在相同条件下再进行3次试验作为批间重复性检验，并对每个浓度进行3次的批内重复性检验。通过将每个测试样品的标准偏差(SD)除以平均值，计算出批间变异系数和批内变异系数[9]。

1.10 临床样品检测

对临床采集的不同年龄段(1～6、6～18和18月龄以上)牛群的鼻拭子和粪拭子共156份样品进行BVDV1和BVDV2双重实时荧光定量PCR检测，比较不同年龄牛BVDV的感染情况，同时采用OIE国标普通PCR检测方法进行对比检测[10]。

2 结 果

2.1 重组阳性质粒的构建

应用合成的特异性引物BVDV1-F/R和BVDV2-F/R分别对BVDV1和BVDV2进行普通PCR扩增，片段大小约为379和321 bp(图1)，与预期大小相符。将目的片段克隆至pMD19-T载体中，测序正确，成功构建BVDV1和BVDV2重组质粒。经计算BVDV1和BVDV2的拷贝数分别为3.63×1010和9.5×1010拷贝/μL。

2.2 BVDV1和BVDV2 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件的优化

根据TaqMan实时荧光定量PCR优化结果，BVDV1和BVDV2最适退火温度均为57.0 ℃(图2)。BVDV1和BVDV2的引物最适浓度均为0.5 μmol/L，探针最适浓度均为0.3 μmol/L(图3)。

M，DL500 DNA Marker；1、2，BVDV1；3、4，BVDV2；5，阴性对照M，DL500 DNA Marker;1 and 2，BVDV1；3 and 4，BVDV2；5，Negative control图1 BVDV1和BVDV2 PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of BVDV1 and BVDV2

1～6，BVDV1退火温度为57.0、56.0、59.5、58.0、55.0和58.9 ℃1-6，The annealing temperatures were 57.0,56.0,59.5,58.0,55.0 and 58.9 ℃,respectively图2 BVDV1(A)和BVDV2(B)TaqMan实时荧光定量PCR不同退火温度的扩增结果Fig.2 TaqMan Real-time PCR amplification results of BVDV1 (A) and BVDV2 (B) with different annealing temperatures

图3 BVDV1(A)和BVDV2(B) TaqMan实时荧光定量PCR不同引物、探针浓度的扩增结果Fig.3 TaqMan Real-time PCR amplification results of BVDV1 (A) and BVDV2 (B) with different primer and probe concentrations

2.3 TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线的建立

将BVDV1和BVDV2重组阳性质粒分别进行10倍倍比稀释(103～108拷贝/μL)，建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线，结果见图4。由图4可知，Ct值和BVDV1重组阳性质粒拷贝数的对数之间呈线性相关，标准曲线方程为：Y=-3.54X+37.36(R2=0.990)，扩增效率(E)为92%；Ct值和BVDV2重组阳性质粒拷贝数的对数之间呈线性相关，标准曲线方程为：Y=-3.18X+35.95(R2=0.997)，扩增效率(E)为106%。

2.4 特异性试验

以BVDV1、BVDV2标准阳性毒株及IBRV、BRSV、BPIV3的DNA或cDNA作为模板检测TaqMan实时荧光定量PCR的特异性，结果见图5。由图5可知，除BVDV1和BVDV2模板外，均未检测到其他扩增信号，表明建立的检测方法特异性良好。

图4 BVDV1和BVDV2 TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线Fig.4 The standard curve of TaqMan Real-time PCR of BVDV1 and BVDV2

1～5，分别为BVDV1、BVDV2、IBRV、BRSV和BPIV31-5，BVDV1，BVDV2，IBRV，BRSV and BPIV3，respectively图5 BVDV1和BVDV2 TaqMan双重实时荧光定量PCR方法特异性扩增曲线Fig.5 Specificity amplification curve of TaqMan Real-time PCR of BVDV1 and BVDV2

2.5 敏感性试验

将BVDV1和BVDV2重组阳性质粒分别进行10倍倍比稀释(100～108拷贝/μL)，进行TaqMan实时荧光定量PCR，结果显示，BVDV1和BVDV2重组阳性质粒检测下限均为10拷贝/μL(图6)。BVDV1和BVDV2常规PCR检测下限均为103拷贝/μL(图7)。

2.6 重复性试验

使用浓度为103、105和107拷贝/μL的BVDV1和BVDV2重组阳性质粒为模板进行TaqMan实时荧光定量PCR，通过批间试验和批内试验来评估建立检测方法的可重复性，结果见表2、3。由表2、3可知，批内变异系数为0.17%～1.44%；批间变异系数为0.94%～2.71%。说明该检测方法重复性良好。

2.7 临床样品检测

BVDV1和BVDV2双重TaqMan实时荧光定量PCR检测结果表明，156份样品中共检测出BVDV阳性样品36份，阳性检出率为23.1%，其中BVDV1 28份，BVDV2 8份(表4)。使用OIE国标普通PCR方法进行检测，检出BVDV阳性样品29份，检出率为18.6%。说明所建立的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法敏感性高于普通PCR，更适用于临床检测。

分析不同年龄牛BVDV的感染情况，根据采样牛的年龄分为1～6、6～18和18月龄以上牛。由表4可知，1～6月龄牛的阳性率为35.0%(14/40)，6～18月龄牛的阳性率为13.0%(7/54)，18月龄以上牛的阳性率为24.2%(15/62)。

1～9，分别为108、107、106、105、104、103、102、101和100拷贝/μL1-9，108,107,106,105,104,103,102，101 and 100 copies/μL，respectively图6 BVDV1(A)和BVDV2(B)TaqMan实时荧光定量PCR敏感度扩增曲线Fig.6 Sensitivity test curve of TaqMan Real-time PCR amplification of BVDV1 (A) and BVDV2 (B)

M，DL500 DNA Marker；1，阴性对照；2～10，108、107、106、105、104、103、102、101和100拷贝/μLM，DL500 DNA Marker；1，Negative control；2-10，108,107,106,105,104,103,102,101 and 100 copies/μL，respectively图7 BVDV1(A)和BVDV2(B)普通PCR敏感性试验Fig.7 Sensitivity test of PCR amplification of BVDV1 (A) and BVDV2 (B)

表2 批内重复性试验

表3 批间重复性试验

表4 不同年龄牛BVDV检测情况

3 讨 论

BVDV是导致牛的胃肠道、呼吸道和生殖系统疾病相关的重要病原体，目前已在世界各地广泛流行和蔓延，特别是在养殖业发达的国家，其对中国牛养殖业也造成了较大的经济损失。不同健康状况的牛表现出不同的临床症状，主要包括免疫抑制、繁殖障碍、肠炎、免疫耐受与持续感染、急性或慢性黏膜病等[11]，甚至会损伤机体免疫系统引发其他病毒、细菌混合感染，特别是怀孕早期，血清抗体阴性的母牛一旦感染，常通过胎盘使胎儿产生免疫抑制[12]，如果小牛正常产出，一出生便为持续感染(persistent infection，PI)牛。因为PI牛体内始终带毒，且血清中无保护性抗体，极易传染给小牛，由此造成巨大经济损失。因此，牛群中BVDV的筛查对于牛场的健康发展尤为重要。

由于病毒感染的性质，目前并没有完全治愈病毒感染动物的治疗方法[5]。现阶段，疫苗接种也并未达到消除BVDV相关临床疾病以及明显降低其发病率的理想效果。一个高效准确的检测方法对于发病牛的诊断和牛场生物安全防控尤为重要[13]。目前，BVDV检测方法主要有病毒分离、抗原检测、免疫组织化学法等病原学诊断技术；以病毒中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)为代表的血清学诊断技术；RT-PCR和实时荧光定量PCR等分子生物学诊断技术[13]。其中，实时荧光定量PCR技术具有重复性好、灵敏度高和特异性强等优点。王克栋等[14]建立了BVDV1和BVDV2双重RT-PCR检测方法，比普通PCR更方便快捷。王艳杰等[10]建立了用于检测BVDV1和BVDV2的双重实时荧光定量PCR方法，该方法重复性较好，但敏感性较低。彭雪松等[15]建立了BVDV基因分型三重实时荧光定量RT-PCR方法，该方法能同时检测BVDV 3种基因型，但重复性相对较低。BVDV 5′-UTR全长360～386 bp，通过自身折叠形成特殊的二级结构可调节BVDV基因组的翻译和复制，是BVDV基因组最保守的部分[16]。因此，常根据5′-UTR的序列合成引物检测BVDV或用来对BVDV分型[6]。而由于BVDV是单股正链RNA病毒，结构不稳定，极其容易变异从而不断出现新毒株。因此本研究根据实验室近年来分离毒株及GenBank中具有代表性的95个BVDV的5′-UTR设计合成特异性引物和探针，有效提高了检测的准确性。且与其他检测方法相比，本研究建立的检测方法既保证了实时荧光定量PCR高效、便捷等优点，同时具有较高的敏感性(检测下限为10拷贝/μL)、特异性(对IBRV、BRSV和BPIV3不产生特性扩增)和重复性(变异系数<3%)。

流行病学研究表明，BVDV在西藏地区及山东、青海、云南及吉林省的阳性率分别为27.14%[17]、34.58%[18]、22.19%[19]、16.45%[20]及19.21%[21]，其中在山东省阳性率较高。本研究对吉林省部分牛场采集的临床样品进行检测，结果显示，总体阳性率为23.1%(36/156)，其中BVDV1阳性率为17.9%，BVDV2阳性率为5.1%。不同年龄牛BVDV感染情况分析结果表明，1～6月龄牛的阳性率为35.0%，6～18月龄牛的阳性率为13.0%，18月龄以上牛的阳性率为24.2%。由此可见，1～6月龄的小牛在3个年龄段中感染率最高。综上表明，BVDV在中国流行范围较广，且阳性率有逐年增加的态势。因此，应当加强BVDV的检测和防控，并对BVDV2给予高度重视。

4 结 论

本研究建立的BVDV1和BVDV2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法可快速、准确地鉴别BVDV1和BVDV2感染，为该病的早期诊断和流行病学调查提供了有效手段。