附子提取物对肺癌A549细胞增殖抑制及放射增敏作用的研究

张 琪，刘宇峻，庄喜兵，乔田奎

(复旦大学附属金山医院肿瘤科，上海 201508)

肺癌是我国发病率及死亡率最高的恶性肿瘤[1]，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是其最常见的类型，约占肺癌的85%[2]。手术、放、化疗是非小细胞肺癌的主要治疗手段，放射治疗对于局部晚期、不愿手术或因高龄、合并内科疾病等原因不能手术的患者十分重要[3]。放射抗拒是影响肺癌放射治疗效果的重要因素之一，因此，如何降低肺癌细胞辐射抵抗和改善放射敏感性是一个重大的挑战。

有研究证实，放疗可以诱导细胞凋亡、坏死、细胞裂亡、衰老及其他形式的细胞死亡，其中，放疗诱导的细胞凋亡在过去20 年中得到了较广泛的研究[4-5]。照射(irradiation，IR)激活由B 淋巴细胞瘤-2(B lymphocytoma-2，Bcl-2)家族成员在线粒体水平调节的内在凋亡途径，根据其作用，Bcl-2 家族成员分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，前者促进细胞色素C 从线粒体释放和随后的Caspase 激活，而后者则阻止细胞色素C 从线粒体释放。促凋亡和抗凋亡Bcl-2 蛋白之间的紧密控制平衡决定了细胞色素C 从线粒体释放和凋亡诱导，从而参与治疗反应[6-7]。

附子作为一种中药，在中国传统医学中被广泛应用于恶性肿瘤的临床治疗。近些年研究表明，其具有调节机体免疫功能的作用[8-9]，因此，附子及其提取物或汤剂常被应用于调节机体免疫，改善肿瘤病人术后、化疗后免疫功能，但目前附子与放射治疗联合作用的基础研究较少。本研究探讨附子对肺癌细胞增殖及放射敏感性的影响，以及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肺腺癌A549 细胞株购于中国科学院，胎牛血清购于Gibco公司。RPMI-1640培养基购于HyClone公司。细胞凋亡试剂盒购于BD 公司。结晶紫染色液购于碧云天生物公司。Bcl-2、Bax、β-actin一抗购于南京凯基生物有限公司。Western blot 显影液购于Millipore 公司。附子提取物购自南昌忠勤贸易有限公司，主要成分为附子多糖、皂苷。附子提取物粉末用3 倍体积蒸馏水在100 ℃下微沸处理30 min，溶液在相对离心力(relative centrifugal force，RCF)15 500 g下离心10 min，将上清液用0.22 μm 滤器过滤后浓缩，干燥，制备成冷冻干燥的粉末并储存在4 ℃备用[10-11]。

1.2 照射方法

采用高能直线加速器(瓦里安)，6 MV X射线照射A549 细胞，照射野7 cm×7 cm，源皮距100 cm，照射剂量率200 cGy/min，细胞接受照射剂量为1 000 cGy。

1.3 CCK-8法测定细胞存活率

根据预实验结果，将指数生长期的A549 细胞按每孔5 000 个接种于96 孔细胞培养板中，设3 个复孔，每孔附子浓度分别为0~80 μmol/mL。在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24和48 h[12]；每孔换成RPIM-1640培养基100 μL，分别加入CCK-8 试剂10 μL，再孵育60 min。采用酶标仪在450 nm 波长处检测共同孵育60 min时吸光度D(450)值，按下式计算细胞存活率。

细胞存活率/%=[D(450)实验组-D(450)空白组]/[D(450)对照组-D(450)空白组]×100%

1.4 体外细胞集落形成实验

取对数生长期A549细胞接种于6孔板中，分为单纯X射线照射组与附子处理后X射线组，于贴壁12 h后，X 射线照射组予培养基处理，附子处理后X 射线组予30 μg/L 附子提取物处理，24 h 后对细胞进行X射线照射，每组每孔单次照射剂量分别为0、2、4、6、8、10 Gy，照射后将细胞用胰酶消化，使贴壁细胞脱落，后将细胞吹打成单细胞悬液，分别计数50、100、200、500、800、1 500 个细胞，接种于60 mm的培养皿中，共计12个培养皿，继续培养14 d，约第7 天时换液1 次。取培养皿，用4%多聚甲醛固定，清洗后结晶紫染色。计数大于50个细胞的集落数，并计算细胞存活分数(survival fraction，SF)，SF=(PE处理组/PE对照组)×100%[13]。应用Graphpad Prim 5版软件，单击多靶模型拟合两组细胞存活曲线，并计算两组细胞放射生物学参数：平均致死剂量D0，外推值N，及准阈剂量Dq。

Dq的计算公式为：Dq=D0×lnN。放射增敏比(sensitive enhancement ratio，SER)计算公式为：SER=

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

实验分4 组，分别为：①对照组，未经处理的肿瘤细胞；②X 射线照射组，X 射线照射，细胞贴壁后48 h 进行X 射线照射，细胞接受照射剂量为1 000 cGy 照射野7 cm×7 cm，源皮距100 cm，吸收剂量率200 cGy/min；③附子组，细胞贴 壁后24 h 后使用附子处理，附子最终作用浓度为30 μg/mL，孵育24 h；④附子处理后X 射线照射组，细胞贴壁后24 h 后使用附子处理，附子最终作用浓度为30 μg/mL，孵育24 h 后进行X 射线照射，细胞接受照射剂量为1 000 cGy。上述细胞贴壁72 h 后，用胰蛋白酶消化细胞，加入培养基，用吸管反复吹打成单细胞悬液，取2×105个细胞，细胞采用Annexin V-FITC/PI 双标记法染色，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blot 法 检测A549 细 胞Bcl-2 及Bax 蛋白表达

实验分组和处理同1.5。细胞贴壁72 h 后，各组细胞预冷PBS 冲洗3 遍，加入10% SDS 细胞裂解液，冰上裂解30 min，刮取细胞蛋白，离心后取上清，金属浴100 ℃加热8 min，冷却后每个孔道加入含50 μg蛋白样品，共4 组，另取4 μL 上样Marker 加样。80 V电泳120 min后，湿转法将凝胶转移至PVDF膜，转膜条件为300 mA、50 min，转膜完成后，将PVDF膜用封闭液(10%脱脂牛奶)室温封闭1 h。封闭完成后，膜分别由特异抗Bcl-2、Bax、β-actin 抗体孵育(1∶500 稀释，5%的封闭液)。β-actin 被用作内参(1∶1 500 稀释，5%的封闭液)。洗完膜后，在5%的缓冲液中由二抗孵育(1∶2 000 稀释)。将Millipore 显影液按1∶1比例配制成发光液，于上海Tanon 化学发光成像系统检测并分析蛋白条带灰度值。

1.7 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计量资料以xˉ±s表示，组间比较采用方差分析；应用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计图形制作，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度附子对细胞存活率的影响

如图1 所示，A549 细胞附子孵育后24 与48 h后，低浓度附子(20 μg/mL)孵育后的A549细胞增殖活力升高，表明20 μg/mL 浓度附子对细胞存活率有一定提高作用；当浓度＞30 μg/mL，A549细胞存活率明显下降，且随着附子浓度的增加，对细胞活力的抑制程度加强。根据不同浓度的附子及作用时间下A549细胞的存活率，计算出附子提取物的IC20为27.867 μg/mL，IC50为65.949 μg/mL，放射增敏实验选择附子终浓度为30 μg/mL。

图1 不同浓度附子及作用时间对A549细胞增殖的影响

2.2 放射敏感性检测

本研究以SER作为评价辐射增敏剂增敏效果的主要指标。如图2 所示，附子处理后X 射线照射组细胞起始处肩部稍窄，X 线照射组和附子处理后X 射线照射组平均致死剂量D0分别为1.83 和1.48 Gy，SER 为1.24 倍。两组细胞在不同剂量照射时的放射生物学参数D0值(平均致死剂量)、Dq值(准阈剂量)和外推N值见表1，结果显示，30 μg/mL附子提取物对人肺癌A549细胞有明显放射增敏作用。

图2 不同处理组肺癌细胞存活曲线

表1 各组A549细胞放射增敏比的比较

2.3 各组A549细胞凋亡率检测结果

流式细胞术检测结果见图3，对照组细胞凋亡率为3.2%，附子组为5.9%，X射线照射组为13.2%，附子处理后X 射线照射组为18.8%，各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)，且附子处理后X射线照射组细胞凋亡率高于附子组和X线照射组(P＜0.05)，表明一定浓度的附子可增加A549细胞的凋亡率，且与X射线照射联合后，能够进一步增加细胞凋亡率。

图3 流式细胞术检测不同实验组细胞凋亡情况

2.4 不同处理组A549细胞凋亡相关蛋白的表达

Western blot 检测结果如图4所示，显示X射线及附子提取物均能促进A549细胞Bax蛋白的表达，抑制Bcl-2 蛋白的表达。比较各组细胞的Bcl-2/Bax 蛋白相对表达水平，发现附子处理后X射线照射组不仅低于对照组，也低于附子以及X射线单独处理组(P＜0.05或0.01)。

图4 A549细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的Western blot检测结果

3 讨 论

中医认为中医体质与恶性肿瘤发生、进展以及转移均有相关性[15]，有研究发现，肺癌患者以阳虚体质居多[16]。在中医临床治疗肿瘤中多使用大剂量附子、干姜峻补真阳，提高患者抗癌能力[17]，但其治疗肿瘤的具体机制尚不明确。

现代药理研究证实，附子对多种肿瘤有杀伤作用。有研究表明，附子能够诱导胶质瘤及胃癌细胞的凋亡[18-19]，以及通过改善机体的免疫应答抑制机体肿瘤的生长[8-9]。附子中的主要生物活性成分之一的乌头碱被证明能特异性抑制肝癌细胞生长，并呈剂量依赖性，其主要作用机制是激活活性氧的产生，导致细胞色素C 从线粒体释放增加和细胞凋亡的激活，表现在癌细胞中Caspase-3 和Caspase-7 的裂解增加，以及Bax蛋白水平增加和Bcl-2水平降低[20]。此外，另外的有效成分之一的乌头多糖硫酸盐衍生物通过NF-κB/Bcl-2 细胞凋亡信号通路诱导人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞系凋亡[21]。本研究证实，当附子提取物作用A549细胞24及48 h后，能够抑制肿瘤生长，且有时间及剂量依赖性。以上药理作用是本研究选择附子提取物作为放疗增敏剂的重要理论依据。

放射治疗是肺癌的重要治疗方式之一，而肺癌细胞对放射线的抗拒性往往导致放疗失败，因此，探索合适的放射增敏剂是提高肺癌疗效的重要途径之一。本实验选择IC20作为附子实验浓度，约30 μg/mL。集落形成实验可发现，给予附子处理后肺癌A549 细胞存活曲线肩部明显变窄，D0、Dq和N均降低，放射增敏比＞1，显示附子提取物能够提高肺癌A549 细胞的放射敏感性。

凋亡是肿瘤细胞受电离辐射后产生的主要生物效应，在线粒体介导的凋亡途径中，细胞在生存信号缺失、DNA严重受损、生长因子缺乏等情况下，可通过Bcl 家族的促凋亡成员(Bax 等)与抗凋亡成员(如Bcl-2等)调控线粒体膜通透性，释放凋亡活性物质进入细胞质，引起Caspase级联反应，诱导细胞凋亡[22]。本实验结果可见，30 μg/mL 的附子提取物明显促进肺A549细胞凋亡，且在相同剂量X射线照射下，联合附子提取物的肺癌细胞凋亡率显著增加。

Bax 与Bcl-2 蛋白可形成异源二聚体抑制凋亡，Bax间可形成同源二聚体促进凋亡，即在Bax/Bcl-2途径中Bax促进凋亡而Bcl-2抑制凋亡，并进一步通过细胞色素C 及Caspase-9 等因子激活下游Caspase-3 蛋白，最终诱导细胞凋亡[23-24]。本研究证实，附子提取物和X 射线照射均可一定程度降低肺癌A549 细胞中Bcl-2/Bax的比值，但两者联合处理后，肺癌细胞Bcl-2、Bax 的表达量和Bcl-2/Bax 比值变化更为明显。由此推测，附子对肺癌细胞的放疗射增敏作用可能与上调抑癌基因Bax，下调癌基因Bcl-2的蛋白表达有关。

综上所述，附子提取物联合放疗可提高非小细胞肺癌A549 细胞的放射敏感性，可能有助于克服NSCLC患者的放疗抵抗，减少放疗剂量，减轻放疗相关副反应，可能是一种有前景的NSCLC治疗方法，为NSCLC患者提供了一种新的治疗策略。