常州地区5302例育龄妇女脊髓肌萎缩症筛查结果分析

贾陈波　袁小松　张玢　陈文仪

【摘要】目的评估常州地区脊髓肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）运动神经元存活基因（SMN1）缺失的携带率及筛查效率。方法应用荧光定量PCR对2019年7月至2021年6月5302例育龄妇女进行SMN1基因E7和E8的拷贝数检测。结果113例育龄妇女SMN1基因存在杂合缺失（113/5302，2.13%），其中87例E7和E8同时缺失（87/5302，1.64%），24例E8单独缺失（24/5302，0.45%），2例E7单独缺失（2/5302，0.04%）;85名伴侣被召回检测，发现2对夫妇均存在E7杂合缺失，2例孕妇接受产前诊断，最终确诊1例SMA胎儿。结论常州地区SMN1基因杂合缺失发生率与已报道的汉族人群相近，荧光定量PCR可以用于SMA携带者筛查。

【关键词】脊髓肌萎缩症;SMN1蛋白;出生缺陷防治;携带频率

中图分类号：R715.5文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.007

Analysis on screening results of spinal muscular atrophy in

5302 women of childbearing age in Changzhou

JIA Chenbo， YUAN Xiaosong， ZHANG Bin， CHEN Wenyi

（Department of Medical Genetics， Changzhou Maternity and Child Health Care Hospital

Affiliated to Nanjing Medical University， Changzhou 213000， Jiangsu， China）

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the carrying rate and screening efficiency of survival motor neuron gene （SMN1） deletion in spinal muscular atrophy （SMA） in Changzhou. MethodsFluorescence quantitative PCR was used to detect the copy numbers of E7 and E8 of SMN1 gene in 5302 women of childbearing age from July 2019 to June 2021. ResultsThere were 113 cases with heterozygous deletion in those women （113/5302， 2.13%）， including 87 cases of simultaneous loss of E7 and E8 （87/5302， 1.64%）， 24 cases of single deletion of E8 （24/5302， 0.45%） and 2 cases of single deletion of E7 （2/5302， 0.04%）. 85 partners were recalled for detection， and it was found that 2 couples had E7 heterozygous deletion， 2 pregnant women underwent prenatal diagnosis， and 1 SMA fetus was diagnosed finally. ConclusionThe incidence of loss of heterozygosity of SMN1 gene in Changzhou is similar to that of the reported Han population， and fluorescent quantitative PCR can be used to screen SMA carriers.

【Key words】SMA; SMN1 protein; prevention and treatment of birth defects; carrying frequency

脊髓肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是主要表现为进行性、对称性肌无力和肌萎缩的神经变性的一种常见的致死性神经肌肉遗传病，该病临床表现差异较大[1]。SMA的主要致病基因被确认为运动神经元存活基因（SMN1），5号染色体长臂1区是其定位之处，编码SMN蛋白，同时还有该病的修饰基因SMN2也会被克隆[2]。SMA 患儿约有95%存在着SMN1基因第7外显子的纯合性缺失，由SMN1基因点突变造成的患儿约占5%[3～5]。常州市妇幼保健院于2019年7月開通了SMA基因筛查检测平台，为需要进行出生缺陷防治的育龄人群提供一项选择。本研究旨在分析近年来常州地区SMA的筛查结果，探讨本地区的SMN1基因的携带频率。

1对象与方法1.1对象2019年7月至2021年6月来常州市妇幼保健院进行SMA筛查的育龄人群5302例，其中女性年龄16～49周岁，孕妇孕周4～26 W，召回的男性伴侣年龄21～43周岁。本研究获得医院伦理委员会批准，所有育龄人群及家属均知情同意。

1.2试剂与仪器SMN1外显子缺失检测试剂盒（实时荧光定量PCR法，国械注准：20153402293，上海五色石医学研究股份有限公司），DNA核酸试剂提取盒（江苏康为世纪生物科技股份有限公司），荧光定量PCR仪（ABI-QuantStudio5）。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取使用紫色抗凝管（EDTA-K2）采集筛查对象5 mL外周静脉血，采用DNA核酸试剂提取盒提取外周血DNA基因组，用Nano-100分光光度计测定各基因组DNA浓度，并稀释浓度（10～20 ng/μL），OD260 nm/OD280 nm的比值范围为1.8～2.0。

1.3.2实时荧光定量PCR检测运用SMN1外显子缺失检测试剂盒对SMN1基因的拷贝数进行相关检测。以RPP40基因为内标基因，利用荧光定量PCR法分别对SMN1基因第7外显子（E7）和第8外显子（E8）进行拷贝数相对定量。拷贝数通过系统软件读取，结果无偏倚，无需矫正。反应设阴性对照品（空白对照品），阳性对照品（缺失对照品）以及正常对照品（梯度为1∶2∶4）DNA。每个反应体系为4.0 μL（DNA）+ 2.0 μL（反应液）+10 μL（主反应混合液）+1.2 μL（反应辅助液）+去离子水（2.8 μL），总计为20 μL的反应体系。反应体系配置完成后，需要进行振荡30 s，再用转速为2000 r/min的离心机离心10 s，再放入ABI-QuantStudio5荧光定量PCR仪。PCR扩增反应：95℃热启动（95℃，10 min，循环数：1），变性（95℃，15 s，40个循环），退火与延伸（58℃，1 min，循环数：40），实时收集FAM通道和VIC通道的荧光信号（分别为目的基因和内标基因）。

1.3.3结果判读首先分别计算各个梯度对照品E7反应和E8反应中目的基因与内标基因间的ΔCt值（ΔCt=Ct-Ct），再计算出正常对照品3个梯度的ΔCt值的平均值（ΔCt），之后再计算待测样品目的基因与内参基因Ct值之差（ΔCt），最后算出ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt-ΔCt）。ΔΔCt值>0.8为纯合缺失;-0.5～0.5之间为杂合缺失，<-0.6时判定为未见缺失（见图1[6]）。

1.4统计学方法重点随访SMA基因携带者并通知其相关信息等。采用EXCEL表记录个人信息，并对数据进行排序整理。 图1E7和E8未缺失、杂合缺失、纯合缺失时的图像

2结果2.1SMA携带者筛查结果113例育龄妇女SMN1基因存在杂合缺失（113/5302，2.13%），对这类孕妇的结果进行复检，真阳性筛查效率为100%。其中87例E7和E8同时缺失（87/5302，1.64%），24例E8单独缺失（24/5302，0.45%），2例E7单独缺失（2/5302，0.04%），5302例育龄妇女中有89例孕妇被确认为携带者（89/5302，1.68%），具体缺失类型见表1和表2。

2.2SMA携带者产前诊断结果85名伴侣被召回检测，发现2对夫妇均存在E7杂合缺失，2例孕妇接受产前诊断，最终确诊1例SMA胎儿。确诊胎儿的羊水结果显示为E7纯合缺失，E8杂合缺失，利用MLPA方法分别对胎儿父亲（见图2）、胎儿母亲（见图3）以及胎儿羊水（见图4）进行结果验证，两种方法结果一致。

3讨论脊髓肌萎缩症是常发于儿童的一种常染色体隐性遗传病，多伴有致死性，携带者频率为1/35～1/50，发病率为1/10 000～1/15 000[7]。患有SMA1型是最常见也是最严重的亚型，在6个月前发病，从未学会独立坐着，在无呼吸支持的背景下，极少有能在生命的前两年存活下来的[8]。因此，进行SMA携带者人群筛查是目前针对这类疾病最行之有效的方法之一。

本研究对常州地区5302名育龄妇女进行了SMA携带者筛查，筛查出89例为携带者，成功阻断了1例SMA新生儿患儿的出生，并确定了本地区的携带频率为1∶59。另外本研究对这些携带者进行复检，结果一致，真阳性筛查效率为100%。需要产前诊断的2例均进行了多种方法验证，结果相符。目前SMA携带者筛查在以色列、美国[9]、中国台湾省[10]等国家及地区都已经进入临床常规筛查，这些筛查结果表明人群和种族的差异会带来SMA携带者频率之间的差异。近几年上海（90/4719，1∶52）[11]、广西（61/4931，1∶61）[12]、陕西（123/6609，1∶54）[13]及云南地区（62/3049，1∶49）[14]分别报道了所在地区的SMA筛查结果，除广西地区外其他地区结果均与本研究相接近（广西地区分析原因可能是样本量不足，随着样本量的增加频率会接近上述其他地区），另外江苏南京地区[15]最近刚报道了所在地区的筛查携带频率为1∶58，与我院所报道的数据相接近。

我国是人口大国，因此导致SMA携带者也有巨大的数目，由于潜在的传递致病基因，此类人群会有生育SMA患儿的风险;其次SMA疾病临床症状严重，病死率高，加重家庭负担;降低SMA发病率的有效途径就是进行SMA筛查。另外还需要建立完善的疾病预防体系，最终让本国人群SMA的发病率降至最低。参考文献[1] LUNN M R，WANG C H.Spinal muscular atrophy[J].Lancet，2008，371（9630）：2120-2133.

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（收稿日期：2021-09-07修回日期：2021-12-31）

（编辑：潘明志）