电针联合关节松动术对家兔膝关节炎模型Notch信号通路及软骨细胞中Notch3和Dll1蛋白表达的影响研究

黄医明,王树东,郭海清,张胜楠

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是常见的一种以膝周疼痛、关节功能下降为临床特征的退行性关节疾病，是影响中老年人运动、导致疼痛及慢性残疾的首要原因，其发病机制复杂，具有高发病率、高致残率的特点[1-2]。目前KOA的中西医治疗方法很多，但都不能从根本上解决疼痛和功能障碍问题。KOA病变时最先和最主要侵犯的部位是关节软骨，而软骨细胞是关节软骨内合成软骨基质的唯一细胞。最近的研究发现[3]，在膝关节炎发生过程中多伴随软骨细胞间信号转导的异常，前期实验研究发现[4-5]，Notch信号通路的激活与抑制在参加并调控软骨细胞增殖、凋亡过程中对关节软骨的发育及改善膝关节炎的发展扮演着重要角色。此外，针灸作为中医特色疗法之一，治疗膝骨关节炎也被广泛用于临床中[6]。因此，本研究试从Notch信号通路入手，观察电针联合关节松动术对软骨细胞内Notch信号通路的相关受体配体的蛋白表达情况及对软骨细胞凋亡的影响，来探究KOA的多元化治疗方式及治疗机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32只日本大耳白兔,体质量(2.5±0.5)kg，雌雄各半，伦理批号：21000042020050,动物来源沈阳茂华生物科技有限公司,许可证号：SCXK(辽)2017-0001，实验过程中均严格按照实验动物伦理规范操作。

1.2 实验试剂与主要仪器

Notch3-抗兔多克隆抗体、Dll1-抗兔多克隆抗体和HRP-兔抗山羊IgG(武汉博士德生物工程有限公司);10 %中性甲醛溶液及二甲苯、苏木素溶液和1 %醇溶性伊红溶液(辽宁中医药大学实验楼);盐酸氨基葡萄糖(奥泰零国药准字 HC20140008);生物机能实验系统(泰盟科技，BL-420S)；组织脱水机、组织包埋机、石蜡切片机和染色机(英国Shandon公司)；显微镜LW600LT(北京测维光电仪器)；10 %水合氯醛溶液(辽宁中医药大学实验楼)；手术刀、缝合线(鱼跃集团)；电针仪(YUWELL);针灸针(华佗牌，0.25 mm×25 mm)；EPS300 电泳仪(天能科技)；凝胶成像分析系统(Alpha)等。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立 所有大耳白兔常规喂养1周，室温恒定于(24±1)℃、湿度50 %～70 %，定期紫外线消毒，随机抽取10只兔做空白对照，其余兔未发现异常后进入造模阶段。具体造模如下:经兔耳缘静脉注射10 %水合氯醛溶液，麻醉后采用Hulth方法[7],将家兔仰卧位固定，剔除左膝关节兔毛，碘伏消毒，沿左膝关节髌骨内侧切开，切断前后交叉韧带及外侧副韧带，检测抽屉实验阳性[8]，术中避免损伤关节软骨以及术后感染。术后不固定，分笼饲养自由活动，可每日驱赶1次。

1.3.2 模型评价 采用改良的Lequesne MG评分标准[9]对模型组大耳白兔的膝关节进行测量评估，包括局部疼痛、刺激反应、关节活动幅度、关节肿胀程度及步态改变几个方面，评分8分以上即提示模型成功。随机抽取空白兔和造模兔各3只，处死后取关节软骨组织进行形态及病理学比较，造模组可见软骨表面粗糙且软骨细胞排列错乱，未造模家兔软骨表面光滑且软骨细胞排列有序，提示造模成功。

1.3.3 模型分组 造模成功后家兔模型随机分成模型组、西药组、电针松动术组与空白对照组，共4组，每组6只。

1.3.4 干预方法 ①空白组及模型组：正常饲养；②西药组：根据等计量比值表参照临床70 kg体重患者日服量进行折算[9],以每只大耳白兔按20 mg/kg灌服盐酸氨基葡萄糖，每日1次，连续5周；③电针松动术组：采用针刺阳陵泉、犊鼻及足三里穴，实验过程中家兔的穴位定位参照《实验针灸学》[10]，各穴位直刺1 cm并在针刺过程中针柄连接电针仪，通电调节疏密波(频率5～20 Hz,疏波密波交替进行，持续时间各1.5 s)，以兔腿微微颤动为宜，15 min/次。电针达疗程后，再进行关节松动术(对胫腓关节向后和向前向滑动，对髌骨关节水平摆动，对胫股关节屈伸旋转及膝关节分离牵引)，1次/d，连续5周。

1.3.5 实验标本采集 各组干预5周后，禁食处理1 d，采用空气栓塞法处死家兔，切取不同组家兔股骨远端及内外髁负重面的关节软骨标本组织，并放入4 %多聚甲醛溶液中固定保存。

1.3.6 软骨组织HE染色 ①脱水:取出固定好的膝关节软骨组织，修整成约0.5 cm3大小的组织块，全自动脱水机进行脱水;②包埋:脱水后将组织包埋凝固，将石蜡块固定于切片机上进行切片，切片厚度5 μm,烘干后进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化;③染色:伊红染色液浸染10 min，充分冲洗后，苏木素浸染2 min，1 %盐酸乙醇分化30 s，冲洗后晾干再以中性树胶封片，显微镜下观测染色后每组切片的病理变化并做比较。

1.3.7 Western Blot法检测家兔Notch3及Dll1蛋白表达量 用生理盐水冲洗干净关节软骨组织，将其尽量剪碎后与裂解液按1∶1 000比例混合，使其充分裂解后，以12 000 r/min、4 ℃离心 10 min。使用Invent试剂盒法提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白, 湿转法电转移到PVDF膜上，将 PVDF 膜放入平皿中，加入含5 %脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡，封闭1～2 h。将膜放入含Notch3和Dll1一抗的平皿中，4 ℃摇床振荡孵育过夜，次日吸弃一抗，TBST洗3 次，5 min/次。再用5%脱脂奶粉封闭液以1∶8 000稀释二抗(HRP-兔抗山羊IgG)，室温摇床振荡反应1～2 h，然后用TBST洗膜3 次，5～10 min/次。显色，使用凝胶成像仪成像。通过成像系统观察结果，以目标条带和内参条带灰度值的比值反映各蛋白表达。

1.3.8 免疫组化染色检测软骨细胞中Bax的阳性表达率 4组软骨细胞中的Bax表达均以细胞核为主，染色后可见其免疫阳性细胞呈现棕黄色，在染色均匀的区域随机选取5个以上计数细胞不少于500个的高倍视野，再根据染色细胞所占的百分比来进行评估(染色阳性的软骨细胞/视野内软骨细胞总数×100 %)，取平均数。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组行为学测试即改良的Lequesne MG评分比较

与空白组比较，模型组家兔膝关节活动受限明显，甚者无法屈伸行走，关节肿胀明显,给予关节周围指压刺激后疼痛反应明显;与模型组比较，电针松动术组与西药组的家兔关节活动轻度受限，可行走但伴有跛行,肿胀不明显,且电针松动术组的压痛反应明显低于西药组。治疗前后的改良Lequesne MG评分：与空白组比较，模型组评分估值显著增高(P<0.05);与模型组比较，电针松动术组与西药组均有所下降，且对比治疗之前评分下降趋势明显(P<0.05)。见表1。

表1 各组家兔治疗前后改良Lequesne MG评分比较

2.2 各组软骨表面观察

空白组家兔软骨表面光滑，未见裂纹及溃疡面；模型组家兔软骨表面粗糙，破坏严重，肉眼可见裂纹及明显溃疡面，部分区域伴有软骨面剥落；电针松动术组软骨表面欠光滑，软骨面破坏较轻;西药组与电针松动术组大致相同，但见少量骨赘形成。见图1。

2.3 各组HE染色切片比较

空白组表层软骨细胞的排列比较均匀整齐，潮线完整。模型组表层破裂，凹凸不平，软骨细胞排列紊乱且出现簇聚现象伴有弥漫性增生，有潮线中断或较模糊现象。与模型组比较，电针松动术组与西药组软骨细胞排列较为整齐，潮线轻度紊乱，标本组织软骨细胞数量增加。见图2。

2.4 各组家兔Notch3、Dll1蛋白比较

治疗结束后，与空白组比较，其余3组的Notch3及Dll1的蛋白表达量均升高(P<0.01)，但西药组和电针松动术组的蛋白表达量均低于模型组(P<0.01)，且电针松动术组蛋白表达量略低于西药组(P<0.01)。见表2、图3。

表2 各组软骨细胞中Notch3和Dll1蛋白含量

2.5 各组免疫组化Bax表达比较

与空白组比较，模型组软骨细胞中Bax阳性表达率明显升高(P<0.01)；与模型组比较，西药组与电针松动术组的Bax阳性表达率均有降低(P<0.01)，且电针松动术组比西药组略低(P<0.01)。见表3、图4。

表3 各组软骨细胞中Bax阳性表达率

3 讨论

中医学认为，膝关节炎归属于“痹证”“骨痹”“劳损”等范畴，其病因病机多为年老体衰、筋骨劳伤或外感风寒湿邪而致寒邪痹阻经络，气血不畅，以筋肉、关节麻木疼痛或活动不利为表现[11-12]，所以治疗以益气活血、祛风除湿和温通经脉为原则。阳陵泉作为筋之会穴，是治疗下肢筋骨病之要穴，又有温经通络活血之功[13]。《马丹阳天星十二穴歌》记载:“膝肿并麻木，冷痹及偏风，举足不能起，针入六分止”，指出了阳陵泉作为筋之会穴治疗“筋痹”的特殊作用。犊鼻穴又名外膝眼穴，具有疏风散寒、消肿止痛功效，主治膝痛、麻痹及屈膝不利[14]，是针灸治疗膝关节炎遵循局部近端选穴原则的典型代表。《灵枢·木输》中的“刺犊鼻者，屈不能伸”也是犊鼻治疗膝关节疾病的最早记载。足三里作为胃经合穴，具有扶正祛邪、调和气血之功。本实验在传统针刺的基础上，通电调节为疏密波以加强穴位刺激，同时疏密波本有抗炎镇痛、缓解肌肉筋膜疲劳作用，能够更好地验证KOA家兔模型的症状改善程度。此外，关节松动术作为现代医学康复手段，主要用于治疗力学因素引起的关节功能障碍，通过帮助关节被动活动牵拉刺激关节囊和肌腱筋膜来增大关节间隙，减轻膝关节软骨表面摩擦的同时也增强软骨组织活性，进而起到缓解关节粘连和减轻疼痛作用[15]。本实验将两种治疗方式相结合，为KOA的改善和治疗提供多元化选择。

现代医学关于KOA的发病机制尚未完全明确，其病因多与年龄、性别、职业、遗传因素、体重及骨骼密度等有关[16]。近年来对KOA的发病机制研究主要包括软骨退变、软骨下骨退化、神经传导异常和关节力学改变等几个方面[17-18]。在1989年相关研究结果表明，关节软骨的病理改变是KOA发生的最初诱因，是关节软骨及膝关节周围结缔组织代谢发生退变及损害的结果[19]。而软骨细胞是关节软骨内合成软骨基质的唯一细胞，膝骨关节炎时各种病理因素均直接或间接地作用于软骨细胞，使其调控的软骨基质合成与降解的动态平衡体系朝降解方向倾斜，并最终导致软骨基质的破坏。研究发现[20]电针可通过降低促炎症性细胞因子，抑制滑膜炎症反应。进而通过抑制细胞外基质的分解代谢，减轻软骨损害程度且能够提高KOA模型大鼠的疼痛阈值，从而起到软骨保护及抗炎镇痛作用。

Notch信号通路是细胞在进化过程中决定细胞新生衰败的一种高度保守机制，其维持着成熟组织的内部稳态[21]。研究表明，Notch信号通路具有调节软骨合成代谢、分解代谢和纤维化基因调节的复杂性，参与并调控软骨细胞增殖、分化、凋亡的过程进而诱导KOA的发生发展[22-23]。Notch3、Dll1作为Notch信号转导过程中的重要受体配体蛋白，是验证信号通路激活与抑制的灵敏载体。相关实验证明，当Notch信号通路激活时，Notch3与Dll1蛋白大量表达，且软骨细胞凋亡程度加重进而使关节软骨损害程度加深，从而促进KOA的发展[24]。此外，Bax作为bcl-2凋亡基因家族中最具代表性的凋亡基因，能够降解DNA损伤修复酶，同时激活核酸内切酶，促进软骨细胞凋亡[25]，为本实验的结果间接提供了Notch信号转导与软骨细胞凋亡的关联性。本实验结果显示，在电针联合关节松动术治疗干预5周后，对比模型组与西药组，其Notch3、Dll1及Bax蛋白的表达量均下降(P<0.05)，尤其与模型组对比效果明显。提示在电针联合松动术的干预方式下，可能对软骨细胞内的Notch信号通路的转导起到了抑制作用，进而降低软骨细胞凋亡程度，从而改善了兔KOA症状表现。但本实验的不足之处是Notch信号通路的受体配体种类数量较少，可能存在其他Notch受体配体的差异性，需要后期的深入研究。

综上，电针联合关节松动术的中医特色治疗手段可以抑制Notch信号通路的转导过程及其相关蛋白Notch3和Dll1的表达，同时可能降低软骨细胞凋亡程度，改善家兔KOA病情程度及活动幅度，对今后的治疗提供多元化选择。