铁死亡在结直肠癌再生细胞放疗抵抗中的作用及其可能的机制

常钰涵，戈雨桐，哈文韬，魏晓为，龚涌灵（南京医科大学附属南京医院暨南京市第一医院 肿瘤科，江苏 南京 210006）

随着人口老龄化和生活方式的改变，近年来中国结直肠癌发病率明显上升，已成为严重威胁人民生命和健康的主要疾病之一。放疗在结直肠癌治疗策略中具有十分重要的地位[1-2]，然而肿瘤细胞放疗抵抗往往导致临床治疗失败，最终影响结直肠癌患者的生活质量与生存[3]。探索肿瘤放疗抵抗机制对于提升结直肠癌整体治疗效果具有重要的转化意义。肿瘤干细胞参与肿瘤放疗抵抗的发生，但由于肿瘤微环境的高度异质性以及传统鉴定方法的局限性，肿瘤干细胞应激防御特征与机制目前尚未完全阐明[4-5]。优化肿瘤干细胞模型、揭示固有放疗抗性的形成一直是肿瘤治疗抵抗研究领域的难点与热点，对提升结直肠癌临床疗效十分关键。基于上述认识，本课题组利用一种新型肿瘤干细胞样细胞模型——肿瘤再生细胞（tumor regenerative cell，TRC）模型探索结直肠癌放疗抵抗机制，并在研究内容方面聚焦一种新型细胞死亡形式——铁死亡，通过结合分子生物学、力学与生物材料的技术研究TRC是否通过抵抗铁死亡进而抵抗放疗，探讨TRC铁死亡抵抗与放疗敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要材料

人结肠癌细胞HCT116购自中国科学院细胞库。McCoy’s 5A培养基、胎牛血清、双抗、DispaseⅡ、0.45 μm PVDF膜、ECL化学放光试剂均购自默克公司，纤维蛋白原（salmon fibrinogen）、凝血酶（salmon thrombin）均购自Searun Holdings公司，胰酶替代物、Lipofectamine 2000、C11-BODIPY试剂、TRIzol试剂均购自美国赛默飞公司，Erastin、Deferasirox（Fe3+chelate）均购自MedChemExpress公司，胰蛋白酶、无血清细胞冻存液均购自苏州新赛美生物科技有限公司，GoTaq®1-Step RT-qPCR System一步法检测试剂盒、MTS试剂盒均购自Promega公司，BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液均购自上海碧云天生物技术有限公司，预制蛋白胶购自南京金斯瑞生物科技有限公司，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均购自Proteintech公司，谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗体购自Abcam公司，酰基辅酶A合成酶长链家族成员 4（acyl-coenzyme A synthetase long-chain family member 4，ACSL4）抗体、β-Tublin抗体均购自 Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养与三维纤维蛋白软胶的制备

用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基在37℃、5% CO2的培养箱中培养结肠癌细胞HCT116。取对数生长期的细胞用来做后续实验。Control细胞为常规培养的结肠癌HCT116细胞，TRC为三维蛋白软胶筛选并培养出的HCT116细胞。参照文献[6-7]，当纤维蛋白原浓度为1 mg/mL时，对应硬度约为90 Pa。根据实验要求，选择不同硬度的纤维蛋白软胶（1、1.5、2 mg/mL），配置含纤维蛋白原和T7缓冲液的细胞混合液，将混合液和凝血酶加入细胞培养板中，在细胞培养箱中静置30 min后补充培养基。次日开始观察TRC形态、大小是否均一。

1.3 制备TRC单细胞悬液

将母液浓度为100 mg/mL的DispaseⅡ溶胶酶稀释到2 mg/mL的工作浓度，在24孔板的每孔中加入200 μL DispaseⅡ，静置5 min直至没有固态凝胶。将所有细胞悬液吸出，加入进15 mL离心管，离心力为219×g，离心3 min；弃上清，加入3～5 mL胰酶替代物重悬细胞沉淀，反复吹打后，置于37℃水浴锅中5 min，重复操作直至在显微镜下观察细胞克隆离散成单细胞，获得TRC单细胞悬液。

1.4 qPCR实验

用TRIzol法分别从Control和TRC细胞中分离提取总RNA，用Nanodrop仪器检测总检测样品的RNA浓度。根据Promega一步法逆转录qPCR试剂盒的说明书配置溶液；设置qPCR反应程序，并使用2-△△CT相对定量算法分析结果。qPCR实验中所使用的引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.5 MTS法检测X-射线照射对TRC增殖的影响

将Control和TRC分别接种在96孔板中，每孔8×102个细胞，培养48 h后用X-射线照射，放回细胞培养箱培养48 h。根据Promega试剂盒的要求加入MTS试剂处理2 h，于酶标仪下检测490 nm波长的光密度（D）值。计算细胞存活率，细胞存活率=实验组D值/对照组D值×100%。

1.6WB实验检测TRC中GPX4、ACSL4的表达

将Control细胞和TRC接种在细胞培养板中，72 h收集细胞并提取总蛋白，使用BCA法进行蛋白定量。按照预制胶操作要求进行SDS-PAGE后转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。用TBST洗膜3次后，分别加入抗β-tublin、GPX4、ACSL4一抗（均按照1∶1 000稀释）4℃过夜。用TPST洗膜3次，加入相应的二抗（按照1∶8 000稀释）常温处理1 h，再次用TBST洗膜3次，按照1∶1配置ECL发光液，用凝胶成像系统进行曝光，最后使用ImageJ软件分析条带的灰度值，计算处理结果。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带的灰度值/内参的条带灰度值。

1.7 克隆形成实验检测TRC的放射敏感性

将Control细胞和TRC接种在细胞培养板中培养24 h，给予不同剂量的X-射线照射（2、4、6、8 Gy）后，放回细胞培养箱培养48 h，收集单细胞悬液，根据辐照梯度的不同剂量，按照梯度倍数稀释的方法稀释Control和TRC细胞，接种到6 cm细胞培养皿中，每个实验条件设置3个复孔，培养2周。定时观察培养皿中的细胞克隆，当出现肉眼可观察到的克隆之后终止培养。在PBS清洗3次且用甲醛固定细胞后，加入适量的结晶紫染剂进行染色。细胞幸存指数=（处理组克隆形成数/处理组接种细胞数）/Control组克隆形成率×100%；Control组克隆形成率=（Control组克隆形成数/Control组接种细胞数）×100%。

1.8 共聚焦显微镜观察TRC的铁死亡水平

将Control细胞和TRC接种在细胞培养板中培养48 h，在用不同梯度的X-射线（4、8 Gy）照射后，放回细胞培养箱培养48 h。预先制备C11-BODIPY和Hoechest染色液，每个样品所需的染色液体积对应于用于培养细胞的培养基体积。用PBS清洗3次并加入染液，在细胞培养箱处理15 min后，避光条件下用PBS快速冲洗3次，用共聚焦显微镜进行拍摄。

1.9 流式细胞术检测TRC的脂质过氧化水平

取出培养了48 h的Control细胞和TRC，分别用Erastin和不同剂量的X-射线（4、8 Gy）处理48 h，PBS清洗3次，加入预先制备的2 μmol/L工作浓度的C11-BODIPY染色液，在细胞培养箱处理30 min，PBS清洗3次，将Control细胞和TRC制备成单细胞悬液并转移到离心管中，离心力为219×g离心3 min，收集细胞沉淀。重悬细胞，并将细胞悬液通过400目的网筛进入流式管中。用流式细胞仪检测细胞脂质过氧化水平。每个条件至少获得1×104个细胞颗粒。

1.10 统计学处理

2 结 果

2.1 纤维蛋白软胶筛选的TRC具有高干性和基质硬度依赖性

将结肠癌细胞HCT116培养在90 Pa的三维纤维蛋白软胶中6 d，筛选出TRC（图1A），在90 Pa的纤维蛋白软胶中，TRC展现出了良好的形态和旺盛的增殖能力（图1B）。在第6天提取HCT116细胞的总mRNA，通过对干性基因 CD44、SOX2、TWIST、NANOG、SOX17、BMI1、PTPRT以及分化基因GATA6、CK7等进行qPCR检测，结果（图1C）表明，结直肠TRC呈现出大量干性基因高表达且分化基因低表达的分子模式；且随纤维蛋白软胶的硬度（1、1.5、2 mg/mL）改变，干性基因和分化基因的表达呈现基质硬度依赖性。以上数据证实，三维基质胶筛选出的TRC为结直肠癌干性细胞，可作为结直肠癌干细胞研究模型。本研究以状态更为稳定的HCT116培养的Control细胞和TRC为研究主体展开后续功能及机制研究。

2.2 结直肠癌TRC具有较高水平的放疗抵抗

为了检测Control细胞和TRC对放疗的耐受水平，用不同剂量的X-射线（2、4、6、8 Gy）照射细胞，MTS法检测结果（图2A）显示，TRC细胞的细胞存活率均显著高于Control组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。克隆形成实验结果（图 2B、C）表明，在经过不同剂量的辐照（0、4、8 Gy)后，TRC的克隆数量较Control细胞显著升高，TRC的细胞幸存指数均高于Control细胞（均P＜0.05）。以上数据表明，TRC的放疗抵抗能力远强于Control细胞。

2.3 结直肠癌TRC的放疗抵抗与脂质过氧化密切相关

为了探索结直肠癌TRC产生放疗抵抗潜在的机制，检测铁死亡与TRC放疗抵抗的相关性。脂质过氧化是发生铁死亡的重要标志，当用C11-BODIPY标定脂质过氧化时，红色荧光为还原态，绿色荧光为氧化态。本研究用C11-BODIPY对样品进行染色以检测不同处理组细胞的脂质过氧化水平，分别采用共聚焦显微镜和流式细胞术观察并标定其铁死亡水平。共聚焦显微镜下观察的结果（图3A、B）表明，在经过X-射线（4、8 Gy）照射后，与0 Gy组Control细胞相比，4、8 Gy组Control细胞的绿色荧光更强，发生了脂质过氧化，并且随X-射线剂量的增加，Control细胞的绿色荧光水平也升高；而观察单个TRC克隆发现，各组TRC几乎没有绿色荧光，表现出了X-射线抵抗。用铁螯合剂Deferasirox（Fe3+chelate）（DFO）和8 Gy射线联合处理后，结果显示，Control细胞因辐射产生的脂质过氧化被逆转，而TRC无明显改变。另外，C11-BODIPY染色（以30 μmol/L Erastin处理组作为阳性对照）后通过流式细胞术检测发现，与DMSO组相比，经过Erastin处理后的Control细胞发生了明显的脂质过氧化（P＜0.05），而TRC没有发生脂质过氧化（P＞0.05）；Control细胞在经过不同剂量的辐照后（4、8 Gy），和0 Gy组相比，4、8Gy辐照处理组的细胞发生了更高水平的脂质过氧化（均P＜0.05），而TRC各组的脂质过氧化水平没有发生显著改变（均P＞0.05）（图3C）。这些结果表明，结直肠癌TRC的放疗抵抗与脂质过氧化密切相关，其可能通过抵抗铁死亡来抵抗放疗。

2.4 结直肠癌TRC可能通过抵抗铁死亡参与其放疗抵抗

为了进一步检测结直肠癌TRC对铁死亡的抵抗，本研究对细胞行不同浓度铁死亡诱导剂Erastin处理（实验组），用C11-BODIPY对样品进行染色，通过流式细胞术检测其铁死亡发生的水平，实验结果（图4A、B）表明，在不同浓度的Erastin处理下，Control细胞的实验组脂质过氧化水平显著高于对照组（P＜0.05），但没有观察到浓度依赖性；各组TRC脂质过氧化水平之间的差异无统计学意义（P＞0.05），说明结直肠癌TRC显著抵抗铁死亡。因此推测，结直肠癌TRC可能通过抵抗铁死亡参与其放疗抵抗。

2.5 结直肠癌TRC可能通过高表达GPX4和低表达ACSL4抵抗铁死亡

为了进一步探索结直肠癌TRC抵抗铁死亡的分子机制，本研究检测了结直肠TRC中铁死亡关键调控分子GPX4和ACSL4的表达水平。在细胞培养的第6天收取Control细胞和TRC样品的总RNA，qPCR法检测结果（图5A）表明，与Control细胞相比，TRC高表达GPX4、低表达ACSL4（均P＜0.05）；在细胞培养的第6天收取0 Gy或8 Gy处理组的Control细胞和TRC总蛋白，WB法检测结果（图5B、C）表明，经8 Gy射线处理后，Control细胞的ACSL4蛋白相对表达水平升高，GPX4相对表达水平下降，而TRC与之相反（均P＜0.05）；在细胞培养的第6天收取不同浓度的Erastin处理后（实验组）的Control和TRC细胞总蛋白，WB法检测结果（图6）证实，与DMSO组相比，实验组Control细胞低表达GPX4、高表达ACSL4，TRC则与之相反（均P＜0.05）；相比Control细胞的实验组，TRC的实验组高表达GPX4、低表达ACSL4，并且随着Erstin的浓度升高，GPX4的表达量升高，ACSL4的表达量随之降低（均P＜0.05）。这些数据提示，结直肠癌TRC在铁死亡诱导条件下，可能通过高表达GPX4和低表达ACSL4抵抗铁死亡。

3 讨论

结直肠癌是较为常见的消化道恶性肿瘤之一，放射治疗作为其重要的治疗方式，被广泛推荐应用于T3期以上或淋巴结转移且无全身转移的中晚期直肠癌患者的治疗[8]，其主要模式为新辅助/辅助治疗、根治性治疗、转化性治疗和姑息治疗[9]。但是放疗的疗效并不理想，仅有1/3的患者对放疗相对敏感，甚至有些患者会出现放疗抵抗[10]。因此，确定放疗抵抗的原因及其分子机制对于优化结直肠癌患者的治疗方案至关重要。

目前的研究结果多支持结直肠肿瘤干细胞是结直肠癌治疗抵抗和疾病复发的根源，常规疗法通常针对增殖和成熟的肿瘤细胞，而结直肠肿瘤干细胞大多处于静止状态且分化较差，因此容易在放化疗的损伤中存活[11]。2012年，LIU等[6]基于细胞外基质的物理特性对细胞干性及转化的调控研究[7]结果，在硬度约为90 Pa的三维纤维蛋白软胶中培养并筛选出了具有高致瘤能力的TRC，其能够驱使肿瘤形成和转移。本研究在纤维蛋白软胶中筛选和培养出具有高致瘤能力、高干性的结直肠癌TRC，进一步通过MTS法及克隆形成实验证实了TRC经放疗后仍具有良好的细胞增殖能力，相较于常规培养的细胞能有效抵抗放疗损害，这与DAS等[11]的发现一致。

目前，TRC通过何种机制发挥其放疗的抵抗作用仍不明确，本研究的结果数据表明，结直肠癌TRC可能通过抵抗铁死亡参与其放疗抵抗。铁死亡是一种铁离子依赖性的、以细胞内ROS堆积为主要特征的非凋亡性细胞坏死[12]，能够促进肿瘤细胞对治疗的抵抗[13]。GPX4能够利用谷胱甘肽将过氧化的脂质还原成无毒的脂醇，从而抵抗铁死亡，这也是细胞抵抗铁死亡的重要机制之一[14]。因此，细胞可能通过高表达铁死亡的负调控因子GPX4从而抵抗放疗[15]。另外，ACSL4能够将游离脂肪酸转化为铁死亡所需的脂酰CoA，从而驱动铁死亡[12，16-18]。放疗会通过上调ACSL4的表达促进铁死亡所需的重要中间产物的生物合成[19]，因此缺失ACSL4的细胞能够显著抵抗GPX4抑制诱导的铁死亡[20]。在此基础上，本研究发现，与Control细胞相比，TRC中GPX4呈高表达、ACSL4呈低表达，并且随着Erastin的浓度升高，GPX4的表达量升高、ACSL4的表达量降低。这些数据都提示了TRC具有天然抵抗铁死亡的潜能。功能实验也证实，放疗诱发了结直肠癌细胞的铁死亡以及TRC的铁死亡抵抗。

综上所述，本研究通过模拟肿瘤细胞在体内真实的物理生存环境，建立具有干性的结直肠癌TRC模型，并以该模型研究TRC的放疗抵抗机制，发现其可能通过高表达GPX4，低表达ACSL4抵抗铁死亡，从而抵抗放疗的潜在机制。本研究提出的TRC抵抗铁死亡的现象与当前铁死亡研究领域认为的铁死亡或可特异性靶向肿瘤干细胞的观点是冲突的，但也是新颖的，为结直肠癌铁死亡诱导疗法提供了实验基础，对未来肿瘤的铁死亡疗法的临床转化有一定的参考价值。同时，本研究仍存在诸多局限性，如对于TRC可能通过铁死亡抵抗放疗的研究较为浅显，目前发现了GPX4、ACSL4等关键的铁死亡调控分子在其中发挥重要作用，而更深入的机制以及有临床转化价值的新靶点有待未来更为深入的探索。