lncRNATUG1通过miR-524-5p/BRAF轴调节甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的增殖、凋亡和EMT进程

李秀君，刘宝利，朱翠敏（.河北省唐山市工人医院病理科，河北 唐山 063003；.承德医学院附属医院肿瘤科，河北 承德 06700）

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌的亚型之一，占所有甲状腺恶性肿瘤的80%，多数PTC可被治愈，仍有部分患者治疗后发生复发与转移，影响其预后。EMT是PTC发展的关键步骤，因此研究PTC发生发展机制，寻找新的治疗靶点具有重要意义[1-2]。牛磺酸上调基因1（taurine up-regulated gene 1，TUG1）为lncRNA之一，有研究[3]发现，lncRNA TUG1在PTC组织与细胞系中表达上调，上调lncRNA TUG1表达可显著促进PTC细胞增殖与侵袭，而下调lncRNA TUG1可明显抑制细胞增殖、迁移与侵袭。lncRNA通过作为内源性竞争性RNA通过结合miRNA影响疾病进展，lncRNATUG1通过结合miR-524-5p来介导无远端同源盒1（distalless homeobox 1，DLX1）基因的表达从而调控口腔鳞癌的发展[4]。有研究[5]发现，miR-524-5p在PTC组织与细胞中低表达，可影响PTC细胞活力、迁移、侵袭和凋亡。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因与PTC的发展密切相关，其基因突变与PTC患者的临床病理特征和预后相关[6]。有研究[7]表明，miR-524-5p通过靶向BRAF和ERK2抑制黑色素瘤的生长。lncRNA TUG1是否通过调控miR-524-5p/BRAF轴影响PTC发生发展尚未见报道。本研究将探索lncRNA TUG1对PTC细胞增殖、凋亡、EMT进程的影响及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞及主要试剂

选择2019年5月至2021年4月间在河北省唐山市工人医院手术切除的35例PTC组织及对应癌旁组织标本。患者术前未经任何放化疗，年龄29～72岁，平均年龄（60.10±9.30）岁，经病理诊断均为PTC。本研究方案经本院伦理委员会批准（批准号：GRYYLL-KJ2019-K43），所有患者知情同意并签署知情同意书。

人PTC细胞TPC-1、BHP10-3、K1、SW-1736及人正常甲状腺上皮细胞Nthyori 3-1均购自美国ATCC公司，RPMI 1640培养基（SH30809.01）、胎牛血清（SH30068.03）购自美国Hyclone公司。抑制lncRNA TUG1表达质粒（si-TUG1）及对照质粒（si-NC）、miR-524-5p过表达质粒（miR-524-5p mimic）及对照质粒（miR-NC）、抑制miR-524-5p表达质粒（miR-524-5p inhibitor）及对照质粒（NC inhibitor）、BRAF过表达质粒（pcDNA BRAF）及对照质粒（pcDNA），以及miR-524-5p、lncRNA TUG1及 U6、GAPDH 引物均购自GenePharma公司。TRIzol试剂（R0016）、BeyoRTTMⅡcDNA第一链合成试剂盒（D7168M）、BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（D7260）、CCK-8试剂盒（C0038）均购自Beyotime公司，Lipofectamine®3000转染试剂（L3000008）购自Invitrogen公司，双荧光素酶活性检测试剂盒（ZY130595）购自泽叶生物公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒（CA1020）购自北京索莱宝公司，兔抗人BRAF（9433）、PCNA（13110）、Caspase-3（14220）抗体均购自美国CST公司，兔抗E-cadherin（ab76319） 、 N-cadherin（ab245827） 、 vimentin（ab92547）抗体及HRP标记羊抗兔二抗（ab6721）均购自Abcam公司。

1.2 细胞培养及转染

TPC-1、BHP10-3、K1、SW1736、Nthyori 3-1细胞均用含10%的RPMI 1640培养基进行培养。

将TPC-1细胞分为对照组、si-NC组、si-TUG1组、miR-NC组、miR-524-5p mimic组、si-TUG1+miR-524-5p inhibitor组、si-TUG1+NC inhibitor组、miR-524-5p mimic+pcDNA组和miR-524-5p mimic+pcDNA BRAF组，选择对数生长期TPC-1细胞，以每孔4×105个细胞接种至6孔板中，待细胞汇合度至约70%时，按上述分组进行转染，转染6 h后更换新的RPMI 1640培养基继续培养48 h，进行鉴定转染效率检测实验。

1.3 qPCR检测PTC组织和细胞中lncRNA TUG1、miR-524-5p表达

TRIzol试剂提取PTC组织及细胞总RNA，BeyoRTTMⅡcDNA第一链合成试剂盒合成cDNA后，采用SYBR Green法试剂盒进行qPCR实验。qPCR反应条件为95℃预变性5 min，95℃ 30 s、65℃45 s，40个循环，72 ℃ 5 min。以GAPDH、U6为内参基因，采用 2-ΔΔCt方法计算 lncRNA TUG1、miR-524-5p的相对表达量。lncRNA TUG1的正向引物为5′-CTATACTCAGCTTCAGTGTT-3′，反向引物为5′-TACTGTATGGCCACCACTCC-3′；GAPDH的正向引物为5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物为5′-AGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′；miR-524-5p的正向引物为5′-CTACAAAGGGAA GCACTT-3′，反向引物为5′-GAACATGTCTGCG TATCTC-3′；U6的正向引物为 5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′，反向引物为 5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′。

1.4 双荧光素酶报告基因实验验证miR-524-5p与lncRNATUG1、BRAF之间的靶向关系

数据库（Microrna、StarBase和RegRNA）预测结果显示miR-524-5p与lncRNA TUG1、BRAF之间有结合位点，根据结合区域序列，分别构建TUG1-WT、BRAF-WT野生型荧光素酶质粒与TUG1-MUT、BRAF-MUT突变荧光素酶质粒，将构建质粒分别和miR-NC、miR-524-5p mimic共转染TPC-1细胞，转染48 h后，裂解细胞，检测荧光素酶活性。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

各组转染后TPC-1细胞生长至对数期时，以每孔2×104个接种至96孔板中，分别在培养24、48、72 h时每孔加入10 μLCCK-8溶液，继续培养2 h，酶标仪测定在波长450 nm处光密度（D）值，绘制细胞生长曲线。

1.6 FCM法检测细胞凋亡

转染48 h的各组TPC-1细胞，制备成1×106个/mL的细胞悬液，使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，计算细胞凋亡率。

1.7 WB法检测转染后TPC-1细胞中BRAF、PCNA、Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表达的影响

收集转染后的各组TPC-1细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白用10%SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封闭后，分别加入BRAF、PCNA、Caspase-3、E-cadherin（均 1∶1 000 稀释）、N-cadherin（1∶1 500稀释）、vimentin（1∶1 000 稀释）一抗，4℃处理过夜，加入HRP标记的羊抗兔二抗（1∶1 500稀释），室温处理2 h，加入ECL显色液显色，以β-actin为内参，Image J软件分析蛋白相对表达量。

1.8 统计学处理

以上主要实验均独立重复3次。采用SPSS 25.0进行数据统计，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验；GraphPad Prism 8.0绘制生长曲线。以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 lncRNA TUG1在PTC组织及细胞中呈明显高表达

qPCR检测结果显示，lncRNATUG1在PTC组织中表达水平显著高于癌旁组织（2.49±0.29vs1.00±0.11，P＜0.05）。与人正常甲状腺上皮Nthyori 3-1细胞比较，lncRNA TUG1 在 TPC-1（3.48±0.41vs1.00±0.02）、BHP10-3（2.53±0.32vs1.00±0.02）、K1（1.98±0.24vs1.00±0.02）、SW-1736（2.03±0.27vs1.00±0.02）细胞中表达明显处于高水平（均P＜0.05），其中以TPC-1细胞中表达水平最高，故选择TPC-1细胞进行后续实验。

2.2 敲减lncRNATUG1表达可抑制TPC-1细胞增殖及EMT进程而促进其凋亡

qPCR结果显示，与si-NC组比较，si-TUG1组TPC-1细胞lncRNA TUG1表达水平显著降低（0.37±0.05vs0.98±0.10，P＜0.05），说明转染si-TUG1有效地敲减了PTC-1细胞中TUG1的表达水平。CCK-8（图1A）、FCM（图1B）及WB（图1C）法结果显示，与si-NC组比较，si-TUG1组TPC-1细胞增殖能力、PCNA、N-cadherin、vimentin等蛋白的表达水平均显著降低（均P＜0.05），细胞凋亡率（P＜0.05）及其凋亡相关蛋白Caspase-3、E-cadherin的表达水平均显著升高（均P＜0.05），对照组与si-NC组之间上述指标比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。上述结果表明，敲减lncRNA TUG1表达后能抑制TPC-1细胞增殖及EMT进程，并促进其凋亡。

2.3 lncRNATUG1靶向miR-524-5p且抑制其表达

生物信息学软件预测显示lncRNA TUG1与miR-524-5p有结合位点（图2A）；双荧光素酶报告基因实验结果（图2B）显示，与TUG1-WT+miR-NC共转染的TPC-1细胞比较，TUG1-WT+miR-524-5p mimic共转染的TPC-1细胞其相对荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；qPCR 结果显示，敲减 lncRNA TUG1表达后，miR-524-5p表达水平显著升高（图2C，P＜0.05）。上述结果表明，lncRNA TUG1靶向miR-524-5p且抑制其表达。

2.4 过表达miR-524-5p能抑制TPC-1细胞增殖和EMT进程而促进其凋亡

qPCR结果显示，与miR-NC组比较，miR-524-5p mimic组TPC-1细胞miR-524-5p表达水平显著升高（2.36±0.24vs1.05±0.15，P＜0.05），说 明转染miR-524-5pmimic后，TPC-1细胞过表达了miR-524-5p。CCK-8（图3A）、FCM（图3B）及WB法（图 3C）检测结果显示，与miR-NC组比较，miR-524-5p mimic组 TPC-1细胞增殖与 PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表达水平显著降低（均P＜0.05），细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Caspase-3、E-cadherin等表达水平显著升高（均P＜0.05），对照组与miR-NC组之间上述指标比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。上述结果表明，过表达miR-524-5p能抑制TPC-1细胞增殖、EMT进程，促进其凋亡。

2.5 抑制miR-524-5p能逆转敲减TUG1表达对TPC-1细胞增殖、凋亡及EMT进程的影响

CCK-8（图 4A）、FCM（图 4B）及 WB 法（图4C）检测结果显示，与si-TUG1+NC inhibitor组比较，si-TUG1+miR-524-5p inhibitor组TPC-1细胞增殖与PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05），细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Caspase-3、E-cadherin蛋白表达水平显著降低（均P＜0.05），si-TUG1组与si-TUG1+NC inhibitor组之间上述指标比较差异不显著（均P＞0.05）。上述结果表明，抑制miR-524-5p能逆转敲减lncRNA TUG1表达对TPC-1细胞增殖、凋亡及EMT进程的影响。

2.6 miR-524-5p靶向BRAF并抑制其表达

生物信息学软件预测显示BRAF基因与miR-524-5p有靶向结合位点（图5A）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与BRAF-WT与miR-NC共转染细胞比较，BRAF-WT与miR-524-5p mimic共转染细胞相对荧光素酶活性显著降低（图5B，P＜0.05）；WB法结果显示，与miR-NC组比较，过表达miR-524-5p后，miR-524-5p mimic组的BRAF蛋白表达水平显著降低（图5C，P＜0.05）。上述结果表明，miR-524-5p靶向BRAF并抑制其表达。

2.7 过表达BRAF逆转过表达miR-524-5p对TPC-1细胞增殖、凋亡及EMT进程的影响

CCK-8、WB、FCM法检测结果显示，与miR-524-5p mimic+pc-DNA组比较，miR-524-5p mimic+pcDNA BRAF组TPC-1细胞增殖（图6A）与PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表达水平（图6C）显著升高（均P＜0.05），细胞凋亡率（图6B）及凋亡相关蛋白Caspase-3、E-cadherin蛋白表达水平（图6C）显著降低（均P＜0.05），miR-524-5p mimic组 与 miR-524-5p mimic+pc-DNA组之间上述指标比较差异不显著（图6，均P＞0.05）。上述结果表明，过表达BRAF可部分逆转过表达miR-524-5p对TPC-1细胞增殖、凋亡及EMT进程的影响。

3 讨论

lncRNA在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，HOTAIR、MALAT1、H19等多种lncRNA已经被证明是许多癌症发生发展的关键调控因子[8-9]。多种lncRNA与PTC的发展、转移和预后密切相关，可参与调控PTC细胞增殖与迁移等恶性生物学行为[10-11]。lncRNA TUG1与多种肿瘤的发生发展密切相关，在食管癌中，lncRNA TUG1通过结合miR-1294调节PLK1表达影响食管癌细胞的增殖、凋亡和侵袭[12]。已有研究[13]显示，lncRNA TUG1在PTC组织与细胞中表达上调，抑制lncRNA TUG1表达可靶向作用于miR-145，上调锌指E-盒结合同源异形盒-1的表达，抑制PTC细胞的增殖与侵袭。lncRNATUG1还可通过结合miR-382促进胰腺癌细胞增殖、迁移和EMT表型的形成[14]。本研究qPCR结果显示，lncRNA TUG1在PTC组织与细胞中表达水平显著升高，与申伟等[13]研究结果一致。在TPC-1细胞中敲减lncRNA TUG1表达后，TPC-1细胞增殖与PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表达水平显著降低，细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Caspase-3、E-cadherin表达水平显著升高，提示敲减lncRNA TUG1表达可显著抑制TPC-1细胞增殖及EMT进程，并促进细胞凋亡，与先前报道结果[3]类似。

lncRNA可通过作为竞争性内源性RNA结合miRNA参与肿瘤的发生发展[15]。在胃癌中，miR-524-5p可抑制胃癌细胞的生长和侵袭能力，发挥抑癌基因的作用[16]。在乳腺癌中，miR-524-5p可靶向FSTL1抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭和EMT进程[17]。本研究发现，lncRNA TUG1能海绵化miR-524-5p并抑制其作用；TPC-1细胞中敲减lncRNA TUG1表达可上调miR-524-5p表达；TPC-1细胞中过表达miR-524-5p能抑制细胞增殖与PCNA、N-cadherin、vimentin蛋白表达，促进细胞凋亡及Caspase-3、E-cadherin蛋白表达；抑制miR-524-5p表达可逆转敲减lncRNA TUG1表达对TPC-1细胞的作用。上述结果表明，lncRNA TUG1通过靶向miR-524-5p调控PTC细胞增殖、凋亡与EMT进程。

miR-524-5p可与靶基因的3'UTR区结合调控肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭[18-19]。BRAF是MAPK/ERK通路的上游分子，在第600位（V600E）发生的氨基酸改变即V600E显性激活突变，与肿瘤的发生密切相关[20]。研究[21]显示，BRAF在PTC中呈阳性表达，其基因突变与PTC肿瘤直径、淋巴结转移等有关。本研究证实，miR-524-5p与BRAF存在靶向关系，并发现TPC-1细胞中miR-524-5p呈高表达、BRAF呈低表达；过表达BRAF可逆转过表达miR-524-5p对TPC-1细胞增殖、EMT的抑制和凋亡的促进作用，表明miR-524-5p可通过靶向抑制BRAF表达，从而抑制TPC-1细胞增殖及EMT，促进细胞凋亡。

综上所述，lncRNA TUG1在PTC组织与细胞中呈高表达，敲减lncRNA TUG1可通过调节miR-524-5p/BRAF轴抑制PTC细胞增殖与EMT进程、促进细胞凋亡。