ATP-TCA 检测在多发性骨髓瘤患者中的应用价值分析

赵 凡，夏瑞祥（通信作者）

（安徽医科大学第一附属医院血液科 安徽 合肥 230022）

多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞在骨髓中积累，导致骨破坏和骨髓衰竭的恶性肿瘤。治疗上对于全身体能状态良好的患者首选诱导治疗后行自体造血干细胞移植（ASCT），对于不适合ASCT 的患者选择诱导治疗至最大缓解程度后维持治疗。近些年，第3 代免疫调节剂泊马度胺、第2 代蛋白酶体抑制剂卡非佐米、CD38 单抗等药物的出现显著提高了MM 患者的疗效，但在整个治疗过程中，患者反复复发，将不可避免地面临药物的耐药，因此个体化选择给药方案，选择合适的药物组合，降低治疗成本至关重要。ATP-TCA 是一种检测肿瘤细胞体外药物敏感性的一种方法，在新药开发、耐药机制研究及临床决策中均有良好应用。目前已证实该项技术在多种实体肿瘤中的应用价值，在血液系统疾病的新药开发及指导临床用药中也有广泛使用，但是目前为止该项技术在MM 中鲜有报道，因此我们收集了多发性骨髓瘤患者的肿瘤体外药敏结果及其他临床数据来论证ATPTCA 对指导MM 临床治疗的适用性，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

收集2020 年6 月—2021 年3 月就诊于安徽医科大学第一附属医院的63 例多发性骨髓瘤患者的骨髓标本，纳入标准：①符合2016 年国际骨髓瘤工作组（IMWG）多发性骨髓瘤诊断标准，经骨髓细胞学、免疫固定电泳、免疫球蛋白、影像学等检查明确诊断为活动性多发性骨髓瘤；②预计生存时间≥3 个月；③签署知情同意书，同意行骨髓采样送检。排除标准：①合并有其他的危重症疾病以及预计生存时间不满3 个月；②一般情况差不能耐受骨髓穿刺检查；③非初诊初治患者既往接受过除化疗以外的其他类型的治疗（自体造血干细胞移植、免疫治疗等）。63 例患者包括男性36 例，女性27 例，平均年龄66 岁（45 ～89 岁）。免疫球蛋白类型：IGA 12 例，IGD 2 例，IGG 39 例，IGM 1 例，κ 轻链2 例，λ 轻链7 例。

1.2 方法

1.2.1 材料来源 所有的ATP-TCA 标本均采集患者骨髓血，样本采集后于48 h 内低温4 ℃送检，标本送至安徽省精准用药技术工程实验室进行检测。生物培养基及细胞提取液、药敏试剂盒均购买自中科普瑞昇生物有限公司，化疗药物购买自MedChemExpress（MCE）。

1.2.2 ATP 检测方法 细胞分离：将采集的骨髓标本混匀离心后将血细胞沉淀注入淋巴细胞分离液中，吸取淋巴细胞层，加入红细胞裂解液后加入培养基重悬细胞沉淀，备用。细胞质检：取少量样本加入台盼蓝混合后加入计数板，电脑软件计数大细胞和存活细胞比例，采用流式细胞术通过检测CD38（+）、CD138（+）、CD19（-）、CD56（+）抗原确定恶性浆细胞比例。细胞培养：将细胞加入培养基中后分别接种于高通量培养板中（双孔复测），不加药物的细胞作为空白对照，置37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，72 h 后检测生长情况。ATP 检测：加入CTG 化学发光细胞活性检测试剂盒后放入仪器测量发光值。

1.2.3 ATP-TCA 结果判定

以100%峰值血浆浓度（PPC）为筛选浓度，评估药物对自体癌细胞的细胞毒作用，抑制率越高，细胞毒作用越强；抑制率（%）=（1-药物筛选组肿瘤细胞存活数目/空白对照组肿瘤细胞存活数目）×100%。为方便统计将抑制率≥50%定义为药物敏感，抑制率＜50%定义为不敏感。

1.3 临床结果的评估和定义

参考2016 年IMWG 更新的传统疗效评价标准将疗效分为完全缓解（CR）；非常好的部分缓解（VGPR）；部分缓解（PR）；疾病稳定（SD）；疾病进展（PD）；严格意义的完全缓解（sCR）定义为满足CR 标准的基础上，加上血清游离轻链比值正常以及经免疫组化证实骨髓中无克隆性浆细胞，可以用敏感性达到10的多色流式细胞术检测骨髓标本无克隆浆细胞代替。

1.4 统计学方法

实验结果采用SPSS 23.0 软件进行分析。不同药物种类组合间差异采用单因素协方差分析；体外敏感度的影响因素中分类变量采用χ检验，连续变量采用Person 相关性分析；药敏结果与临床数据及临床疗效的相关性采用有序logistics 回归。≤0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 药物体外敏感度的组间差异分析

体外药物及药物组合共7 组。各组抑制率以均数及标准差的形式表示：硼替佐米+来那度胺+地塞米松组（72.30%±22.38%）＞硼替佐米+环磷酰胺+地塞米松组（70.64%±23.61%）＞硼替佐米组（58.05%±28.95%）＞美法仑+泼尼松+沙利度胺组（16.15%±16.16%）＞来那度胺+地塞米松组（16.14%±13.73%）＞环磷酰胺组（11.76%±11.56%）＞来那度胺组（8.93±10.71%）。各组间差异显著，（WelchF = 152.171，＜0.001），见图1。

图1 药敏结果的组间差异

2.2 药敏结果和疗程对缓解程度的影响

研究过程中共36 例患者接受了不少于2 个疗程的化疗并进行了疗效评估，根据患者所采用的临床方案对应的ATP-TCA 数据，将敏感度≥50%分为敏感组，敏感度＜50%分为不敏感组，敏感组29 例，不敏感组7 例，运用有序logistics 回归分析肿瘤药物体外敏感性及疗程对于缓解程度的影响。敏感组的缓解程度明显高于不敏感组，OR 值是不敏感组的8.89 倍（95%：3.38 ～4.04，χ= 19.61，＜0.001）；随着疗程数的增多，缓解程度有所升高，8 个疗程后疗效的OR 值是2 个疗程的6.43 倍，（95%：2.14 ～19.33，χ= 11.00，= 0.001），见图2。敏感组sCR 的获得高于不敏感组，（= 0.028）。

图2 药敏结果对缓解程度的影响

2.3 体外敏感度与临床特征的相关性

根据ATP-TCA 中蛋白酶体敏感性的结果，将患者分为敏感组和不敏感组，在骨髓FISH 检测中，29 名患者检出高危染色体异位，含一项高危因素的有21 例，两项高危因素的有7 例，三项高危因素的有1 例，两组间无显著差异（= 0.761）；两组间免疫表型（CD19, CD20,CD56, CD3, CD4, CD7, CD13, CD33, CD117），高乳酸脱氢酶（LDH），肾功能不全，高钙血症，低蛋白血症均无显著差异，（＞0.05），见表1。

表1 组间临床特征差异

2.4 体外敏感度对生存的影响

最终47 例患者接受了不少于3 个月的随访，根据患者所采用的临床方案的敏感性分为敏感组和不敏感组，其中敏感组35 例，不敏感组12 例，中位随访16 个月后敏感组总生存期（OS）28.5 个月（95%：26.64 ～30.49） 高 于 不 敏 感 组17.8 个 月（95%：13.5 ～22.1），差异显著（χ= 7.38，= 0.007）；敏感组无进展生存期（PFS）27.55 个月（95%：24.48 ～30.61）高于不敏感组16.76 个月（95%：12.47 ～21.04），差异显著（χ= 9.315，= 0.002），见图3。

图3 组间生存差异

3.讨论

肿瘤是目前临床上常见的致死性疾病之一，因为其遗传学上的特征，极易在体内生长扩散且极难根治。虽然大量新药以及免疫疗法的出现显著改善了患者预后，但化疗作为贯穿全程的一部分，最终都将面临肿瘤耐药以及严重不良反应的威胁，因此通过“精准用药”，找到最合适的治疗方法至关重要。在传统的肿瘤药物敏感性检测实验中，因骨髓瘤细胞的不均质性，不同个体的骨髓瘤细胞比例差异大，直接进行药敏检测难以区分正常细胞和癌细胞，因此我们采用流式细胞术，通过检测骨髓瘤细胞特异性抗原对细胞进行分类，确保了骨髓瘤细胞的比例在50%以上，并且采用有选择性培养基进行培养，从而减少了非恶性浆细胞所引起的误差。

在纳入的7 种临床常用的单药及联合组别中，含PIs的方案敏感度更高，这与目前临床上的数据相符。MPT方案表现为体外耐药，这与其抗肿瘤机制有关，烷化剂类药物主要通过烷化作用形成DNA 链间或链内的交联或DNA 与蛋白质之间的交联，属于细胞周期特异性药物，而药敏检验周期短，在这个过程中癌细胞只需保持存活，不需要分裂。

在临床疗效方面，敏感组的患者无论是缓解的深度还是生存的时间都有明显获益。但值得一提的是，有两例敏感组的患者出现了短期内再次复发。在欧洲的一项关于早期复发的模型预测中，对2 190 例患者依据高LDH、FISH 高危因素、低蛋白血症、骨髓浆细胞数和血游离轻链，进行了多发性骨髓瘤简化早期复发（S-ERMM）的评分，结果提示S-ERMM 评分高者易复发，这两例早期复发的患者均为高危型复发型患者，因此临床上对于高风险的患者，我们仍需要引起重视。除此之外，MM 的肿瘤微环境（TME）复杂多变，各种免疫细胞亚群、细胞因子等参与肿瘤的发生与耐药，一些针对靶向微环境的药物依赖于髓内微环境发挥作用，体外培养的过程难以复刻髓内环境，因此ATP-TCA 仅作为临床用药的参考而不能替代实际的疗效。通过这项研究我们发现了ATP-TCA 检测与临床疗效有相关性，可以作为临床药物选择的参考依据。