大黄酸通过抑制CDK9/STAT3途径防治低氧性肺动脉高压

陈马云，姚一竹，朱琳，蔡朝阳，徐梓玮，孙君委，王良兴，黄晓颖

温州医科大学附属第一医院 呼吸与危重症医学科，浙江 温州 325015

低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension, HPH）是一种严重的、危及生命的慢性心肺系统疾病[1]。HOU等[2]发现细胞周期蛋白依赖性激酶9（cyclin-dependent kinases 9, CDK9）通过诱导白细胞介素-6 的产生和分泌，促使信号传导与活化转录因子3（signal transducers and activators of transcription 3, STAT3）和CDK9近端β-FBG启动子结合，从而发挥调节转录的功能。本课题组前期针对CDK9 蛋白进行中药单体有效药物筛选发现大黄酸可显著抑制CDK9 蛋白表达。近年来，STAT3 被报道在HPH血管重塑中扮演重要角色[3]。有研究表明大黄酸可通过抑制STAT3的磷酸化进而抑制多种肿瘤的增殖和诱导其凋亡[4]。但是大黄酸是否通过抑制CDK9以及STAT3磷酸化从而抑制HPH鲜见相关研究。因此，本项研究探索了HPH大鼠模型中大黄酸通过CDK9/STAT3途径对HPH的改善作用以及相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康SPF级雄性SD大鼠，体质量180～300 g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2020-0014。RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白定量检测试剂盒、蛋白酶磷酸酶抑制剂和ECL超敏化学发光底物购买于美国Thermo Fisher Scientific公司，大黄酸单体购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。兔源性STAT3、p-CDK9、CDK9、PCNA、Bax、β-tubulin和Caspase-3抗体购买于美国CST公司，p-STAT3抗体购买于美国Abcam公司，Bcl-2 抗体购买于美国Affinity公司，CC-3抗体购买于美国Proteintech公司。

1.2 动物分组及造模 18只SD大鼠分为3组，每组6只，分为常氧组（N）、低氧组（H）、低氧+大黄酸组（HR）。N组饲养于正常SPF环境；H组和HR组均饲养于同一SPF级环境的低氧舱，维持O2浓度为9.0%～11.0%，用无水氯化钙防止低舱内湿度过高，CO2浓度小于5.0%，总造模时长为4周，每日造模24 h。HR组在造模前，腹腔注射大黄酸，剂量为30 mg/kg，N组、H组大鼠均被腹腔注射等体积溶媒。每日观察SD大鼠进食、饮水情况及运动、精神状态。

1.3 肺动脉压力测定及右心肥厚指数检测 取SD大鼠，称量体质量后，按照体质量计算20%乌拉坦注射液剂量，腹腔给药，注射麻醉后固定大鼠，待其刺激无痛感后，分离出右颈外静脉，行右心导管法测量肺动脉平均压（mean pulmonary artery pressure, mPAP），退出导管并结扎血管。检测完肺动脉压力后，剥离大鼠心脏，去除多余组织后，分离左心室和室间隔（left ventricle+septum,LV+S）、右心室（right ventricle, RV），经枸橼酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）洗净血液后经滤纸吸干进行称重（注意保持吸干程度的一致性），记录右心室和左心室及室间隔重量后，按照公式计算右心肥厚指数，公式为：右心肥厚指数=[RV/（LV+S）][5]。

1.4 肺血管结构重塑指标检测 取大鼠肺组织后，完整分离右肺上叶，将肺组织完全浸泡在4%多聚甲醛，常温放置24 h，按步骤逐步脱水等处理后进行石蜡包埋切片。将石蜡切片进行HE染色，制片染色完成后将玻片放在显微镜下观察，随机拍摄肺中小动脉。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析图片，测量肺中小动脉管壁面积（vessel wall area, WA）及管总面积（vessel total area, TA），计算管壁面积/管总面积（WA/TA），该比值可反映大鼠的肺血管结构重塑的程度。方法同既往报道[6]。

1.5 Western blot检测p-STAT3、STAT3、p-CDK9、CDK9、PCNA、Bcl-2、Bax、Caspase-3、CC-3 蛋白表达量 取各组大鼠等量肺组织匀浆后提取总蛋白，测定各个样本的总蛋白浓度。取组织蛋白样本10 μg行凝胶电泳，电转转膜至PVDF膜后，将PDVF膜放入提前配制的封闭液中封闭，封闭结束后TBST清洗，放入一抗中孵育8 h以上，孵育时温度保持在4 ℃。第2天经TBST清洗后用二抗孵育，洗膜后用化学发光成像仪对PVDF膜进行曝光。曝光后使用凝胶图像分析软件分析并测定条带的灰度值，以β-tubulin为内参，测定目的蛋白的灰度值以及与其对应β-tubulin的灰度值，前者与后者的比值即为该组目的蛋白的相对蛋白表达量，并进行比较。

1.6 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计软件进行统计分析。所有数据均用±s表示，并进行正态性检验判断是否服从正态分布，同时方差齐性检验判断参数是否能用于评估总体。多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠mPAP、右心肥厚指数比较 与N组比，H组大鼠mPAP和右心肥厚指数均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H组比，HR组大鼠mPAP和右心肥厚指数明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 3组大鼠mPAP和右心肥厚指数比较

2.2 3组大鼠肺细小动脉重塑程度的比较 与N组（0.467±0.046）比，H组大鼠WA/TA（0.790±0.033）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H组比，HR组大鼠WA/TA（0.574±0.022）明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；N组肺动脉平滑肌层未见显著增厚，动脉管壁的厚度均匀一致；H组的肺动脉平滑肌细胞可见增生，管腔狭窄，管壁显著增厚；HR组相比H组血管肌化可见减轻，管壁增厚程度下降，管腔狭窄不明显，见图2。

图2 3组大鼠肺血管HE染色图（×400）

2.3 3组大鼠肺组织匀浆p-STAT3/STAT3、p-CDK9、CDK9蛋白表达水平比较 与N组比，H组大鼠肺组织匀浆的p-STAT3/STAT3、p-CDK9、CDK9表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H组比，HR组大鼠肺组织匀浆的p-STAT3/STAT3、p-CDK9、CDK9表达明显减少，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图3 3组大鼠肺组织匀浆p-STAT3/STAT3和p-CDK9、CDK9蛋白条带图及各组间比较图

2.4 3组PASMCs和大鼠肺组织匀浆增殖和凋亡相关蛋白表达水平比较 与N组比，H组大鼠肺组织匀浆的PCNA、Bcl-2表达显著增加，而Caspase-3、CC-3、Bax表达明显减少，差异有统计学意义（均P＜0.05）；与H组比，HR组大鼠肺组织匀浆的PCNA、Bcl-2表达显著减少，而Caspase-3、CC-3、Bax表达显著增加，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 3组大鼠肺组织匀浆PCNA、Caspase-3、Bcl-2、Bax、CC-3蛋白条带图及各组间比较图

3 讨论

肺动脉高压是一种以肺血管阻力持续增加伴随肺血管重塑为特征性变化的慢性肺部疾病[7]，目前临床上虽已有药物用于治疗肺动脉高压，但治疗效果欠佳。因此迫切需要一种更为有效的治疗药物，并深入研究其作用机制和治疗的有效靶点。

大黄酸是一种广泛存在于大黄药材中的蒽醌类提取物，其药理作用广泛，具有显著的抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗纤维化、保肝、护肾等作用[8]。有研究报道大黄酸可有效抑制白细胞介素6刺激下血管平滑肌细胞的增殖效应，并呈剂量和时间依赖性[9]。本研究发现大黄酸能有效减轻肺血管重塑和右心肥厚，使HPH大鼠的肺动脉压力降低。

CDK9 属于细胞周期蛋白依赖性激酶家族的成员，它们不仅调控细胞周期，而且在细胞转录的过程中作为调控因子起着重要的作用。在细胞转录的过程中，能通过调节底物的磷酸化进而调节转录的延长和mRNA的成熟。有研究发现，人非小细胞肺癌（non-small-celllungcancer, NSCLC）组织中CDK9蛋白表达明显上调，在使用CDK9抑制剂和siRNA CDK9后，p-STAT3蛋白表达被抑制，而总的STAT3并无明显下降。通过免疫共沉淀实验进一步证明CDK9 与STAT3直接结合[10]。同时，HOU等[2]的研究也证实CDK9与STAT3的结合。提示CDK9在细胞信号通路中扮演重要角色，并可能是通过调节STAT3的表达产生作用。

STAT3是信号传导活化转录因子家族中的成员之一，其生物学作用广泛，可被环境应激反应（如低氧）、多种炎症因子、生长因子等激活，介导细胞增殖、分化、凋亡等信号的传导[11-12]。肺动脉平滑肌细胞是肺血管的主要成分，有研究发现，在肺动脉高压患者血管分离的PASMCs中STAT3蛋白的磷酸化水平增加，提示其参与肺动脉高压的形成和发展[13-14]。Bcl-2家族调节蛋白（包括促凋亡蛋白Bax等和抗凋亡蛋白Bcl-2等）是线粒体凋亡途径重要的调控因子，起关键性调节作用，在各种促凋亡刺激下，促凋亡蛋白Bax等受到激活，破坏了线粒体膜的完整性，使线粒体内部的蛋白如半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）激活剂、细胞色素C等蛋白被释放进入细胞质，进而激活caspase级联反应，引发细胞凋亡[15]。正常生理情况下，细胞凋亡可以维持机体的稳态。越来越多的研究表明细胞凋亡抵抗出现在低氧诱导的肺动脉高压中[16-17]，暴露于低氧的PASMCs中的抗凋亡相关的蛋白表达明显增多，如Bcl-2，与之对应的促凋亡相关蛋白表达明显受抑制，如Bax，进而参与肺动脉血管的重塑[18]。另有研究表明大黄酸可通过抑制人胰腺癌细胞和结直肠癌细胞中STAT3的磷酸化发挥抗肿瘤作用[3]。近期研究还发现，大黄酸通过抑制STAT3途径，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达而促进促凋亡蛋白Bax的表达来诱导NSCLC细胞凋亡，使细胞周期阻滞在G2/M期[19]。因此，我们推测大黄酸可能通过CDK9途径抑制STAT3的磷酸化从而影响PASMCs的增殖与凋亡达到抑制HPH的作用。本研究结果显示，HPH大鼠肺组织中CDK9、p-STAT3表达上调，而应用大黄酸后有效抑制了CDK9和STAT3的磷酸化。进一步研究发现低氧条件下PCNA、Bcl-2蛋白表达量较常氧明显上调，Caspase-3、CC-3、Bax蛋白表达量明显下调，而大黄酸能有效逆转上述指标的表达。这提示大黄酸减轻HPH可能与其抑制CDK9/STAT3途径有关。

综上所述，大黄酸可以通过抑制CDK9/STAT3途径达到治疗HPH的目的，为其在肺动脉高压防治策略中成为潜在有效药物提供了实验依据。同时，大黄酸是否通过抑制低氧诱导的PASMCs异常增殖并促进PASMCs凋亡机制参与缓解HPH有待进一步研究。