基于甘三酯指纹图谱及化学计量学的青海亚麻籽油掺假识别研究

韩玉泽，王兴瑞，董国鑫，甘生睿，王进英,2

(青海大学农牧学院1，西宁 810016) (青海大学三江源生态与高原农牧业国家重点实验室2，西宁 810016)

亚麻是我国重要的油料经济作物，主要用于亚麻籽油的提取[1,2]。青海省亚麻种植历史悠久，由于青藏高原独特的地理、气候特征，青海亚麻已成为一种宝贵的油料作物。亚麻籽油含有丰富的亚麻酸、蛋白质、木酚素、亚麻籽胶、膳食纤维等对人体具有特殊营养功能的化学成分[3-7]，在心脑血管、糖尿病、癌症等疾病的预防和控制中起着显著作用[8,9]。作为高档食用保健油，较高的市场价格使得亚麻籽油掺假现象多见，不仅严重损害消费者的利益，也影响了亚麻籽油产业的长远发展。为维护食用油消费者和合法生产经营者的权益，建立有效的亚麻籽油掺伪检测方法显得尤为重要。

目前，国内外的油脂检测技术主要有色谱[10-12]、光谱[13,14]、电子鼻[15]等技术。色谱技术是食用油掺伪检测的常用手段，检测油脂中的特征物质组成可以对不同植物油样品进行区分[16]。三酰基甘油作为食用植物油的主要组成成分，占整体成分的95%～98%[17,18]，同时其组成受油脂种类影响较大，因此，可以依据甘三酯甘油骨架上结合脂肪酸的种类以及脂肪酸的分布、构型来识别植物油种类[19]。涂安琪[20]以甘三酯作为标记物结合化学计量学建立了橄榄油中掺假葵花籽油的定量检测方法，可以快速有效地确定橄榄油葵花调和油中的各组分含量。任小娜等[21]采用甘三酯组成分析法以“β-LOL”和 “β-PLL” 含量之和为判断标准对芝麻油中掺入菜籽油的鉴别方法进行了研究。现有的检测方法主要局限于单一指标的检测，而指纹图谱作为一种综合的、可量化的品质鉴定手段，将其与色谱相结合应用于油脂检测可以克服此缺陷。Tsimidou等[22]采用HPLC测定橄榄油中甘三酯并建立指纹图谱，通过主成分分析法可以检测到橄榄油中掺入10%～20%的4种低价植物油。

本研究采用HPLC-RID法全面分析40批亚麻籽油及掺入6种植物油的掺伪油样中甘三酯的组成，建立亚麻籽油甘三酯标准指纹图谱及判别分析模型，旨在为亚麻籽油的评价及质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

40种青海亚麻籽(详见表1)，采用索氏抽提法制得亚麻籽油(料液比0.06 g/mL、抽提温度70、抽提时间8 h)；菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油(金龙鱼)。乙腈、异丙醇，均为色谱纯。

表1 亚麻籽油信息表

1.2 仪器与设备

Shimadzu LC- 20A型液相色谱仪(配备有RID-20A示差折光检测器、CBM-20A控制器、LC-20AD二元泵、SIL-30AC自动进样器、CT0-20AC柱温箱),Inertsil ODS-C18分析型色谱柱(4.6 mm×250 mm；5 μm),XW-80A涡旋混合器,SB-3200TDT超声波清洗机。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

准确称取(1.0±0.01) g油样于10 mL棕色容量瓶中，加入流动相乙腈:异丙醇(30/70)涡旋混匀1 min后定容至刻度，取混匀后的样品溶液经0.45 μm有机滤膜过滤后用于液相色谱分析。

1.3.2 甘三酯测定

HPLC-RID色谱分析条件[23]：Inertsil ODS-C18分析型色谱柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；柱温：40 ℃；流动相∶乙腈-异丙醇(30∶70)；等度洗脱，洗脱时间30 min；流速：0.8 mL/min；进样量：5 μL；检测器温度：30 ℃；

定性分析：与AOCS标准中亚麻籽油甘三酯标准色谱图进行对比，同时结合甘三酯等价碳原子数(ECN)越大，其保留时间越长的出峰规律对亚麻籽油各甘三酯组分进行定性分析。

定量分析：采用峰面积归一化法计算亚麻籽油中各甘三酯的相对含量。

1.3.3 掺伪油样制备

在亚麻籽油中分别掺入菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油，掺入量为10%、20%、30%、40%、50%制备掺伪油样，采用液相色谱分析掺伪油样中甘三酯组成及含量。

1.3.4 指纹图谱构建

按照1.3.1方法制备样品，采用优化后的色谱条件测定40批亚麻籽油样品的甘三酯组成及含量，将得到的液相色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版得到40批样品油原始图谱的叠加图及对照指纹图谱。

1.3.5 数据处理

所有数据平行测定3次，结果取其平均值，利用Microsoft Excel 2010及SPSS 23.0对试验数据统计分析，运用origin 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同植物油甘三酯的组成分析

参考AOCS Official Method Ce 5c-93方法[23]测定亚麻籽油及菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油共7种植物油样品的甘三酯组成，高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

按照ECN由小到大分离甘三酯的规律并结合脂肪酸组成对样品进行定性分析。参考对菜籽油甘三酯的研究[24-26]，OOO(ECN=48)是菜籽油含量最高的甘三酯，因此将菜籽油色谱图中面积最大的峰7定性为ECN 48分区。对大豆油[27]、葵花籽油[26]、玉米油[25,28]甘三酯组分的研究均表明LLO是这3种植物油中含量最高的甘三酯，该甘三酯位于ECN 44分区，因此将大豆油色谱图中的峰5、葵花籽油中的峰4、玉米油色谱图中的峰4定性为ECN 44分区。参考对芝麻油中甘三酯组分的研究[29,30]，OOL是芝麻油中最主要的甘三酯，该甘三酯位于ECN 46分区，因此将芝麻油中峰5定性为ECN 46分区。参考对亚麻籽油甘三酯组分分布的研究[27,31-33]，可以确定亚麻籽油色谱图中峰1为LnLnLn(ECN 36)、峰2为LLnLn(ECN 38)、峰3为OLnLn(ECN 40)、峰4为OLLn(ECN 42)、峰5为OLnO(ECN 44)、峰6为OLnP(ECN 46)、峰7为OOO(ECN 48)、峰8为POO(ECN 48)。

表2 7种植物油甘三酯组成及相对含量/%

对高效液相色谱图中所有甘三酯色谱峰进行面积归一化处理，得到每种甘三酯组分的相对含量，结果见表2。7种植物油中共检测到11种甘三酯，其甘三酯组成及分布规律均具有独特性。有研究表明宁夏亚麻籽油中OLnLn(17.06%)、Ln Ln Ln(12.61%)、LLn Ln(12.24%)含量较高，内蒙古产区亚麻籽油主要甘三酯为OLnLn(17.27%～20.50%)和LnLnLn(11.91%～17.02%)[33,34]。对比发现，我国不同产区亚麻籽油最主要的甘三酯均为OLnLn，其次为LnLnLn，而青海亚麻籽油中这两种甘三酯的含量均高于宁夏、内蒙古地区，除了受亚麻籽品种的影响，还可能与海拔、光照、昼夜温差等气候条件有关。

由于含有丰富的α-亚麻酸，亚麻籽油的主要甘三酯组分与其他几种植物油的差异显著(P<0.05)。油酸油(菜籽油、花生油、芝麻油)中主要甘三酯为OOO，其质量分数占总甘三酯的20.57%～40.91%，还含有2个油酸酰基和另一个饱和脂肪酰基的甘三酯，如OOL、POO。亚油酸油(大豆油、葵花籽油、玉米油)中主要甘三酯是LLL、OLL、OOL，这3种甘三酯占总含量的一半以上。不同植物油独特的甘三酯组成及分布规律为亚麻籽油的掺假识别提供了可行性。

2.2 亚麻籽油甘三酯指纹图谱在掺伪识别中的应用

2.2.1 青海亚麻籽油甘三酯标准指纹图谱的构建

对亚麻籽油甘三酯的色谱图进行积分处理后，将色谱信号导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)，设定S1色谱图为参照图谱，采用中位数法进行多点校正、自动谱峰匹配生成对照图谱。40批亚麻籽油甘三酯色谱图叠加图及相应的对照指纹图谱见图2。共标定8个共有峰，由于3号色谱峰OLnLn的保留时间适中、分离度良好、峰面积较大，因此将其作为参照峰记录各共有峰相对峰面积并进行相似度评价。相似度是国家药典委员会确定的中药指纹图谱标准中的一项重要评价指标[35]，根据其规定，相似度达到90%以上则认为符合该油脂相似度的评定标准[36]，通过夹角余弦法进行相似度评价，40批亚麻籽油样品指纹图谱相似度均达到97%以上，说明青海亚麻籽油样品甘三酯组成具有较好地一致性，故该标准指纹图谱可以全面地表述青海亚麻籽油的甘三酯信息。

注：1～8为不同甘三酯色谱峰，36～48为ECN。图2 青海亚麻籽油甘三酯成分叠加图及其标准指纹图谱

2.2.2 基于指纹图谱相似度的亚麻籽油掺假鉴别

利用相似度评价系统计算掺伪亚麻籽油与纯亚麻籽油的相似度，以掺伪比例为横坐标、对应相似度为纵坐标进行线性拟合，样品掺伪比例越大，其甘三酯图谱与亚麻籽油对照指纹图谱相似度越小，6种植物油掺伪模型均呈递减趋势，相关线性方程见表3。利用各掺伪模型的线性方程计算掺伪量，与实际掺假量对比得到相对误差，结果见表4。6种植物油掺伪模型中掺假量的相对误差平均值均小于1%，可以精确检测掺假。表明当掺入植物油比例为10%及以上时，掺伪模型可以对纯亚麻籽油与掺伪亚麻籽油进行准确区分。

表3 掺伪亚麻籽油掺伪模型曲线方程

表4 掺伪亚麻籽油指纹图谱相似度及相对误差

2.3 判别分析识别亚麻籽油中掺伪植物油种类

判别分析是以一批明确分类的样品建立判别函数进而用此函数对未知样品进行判别的一种统计方法[37]。将40批纯亚麻籽油命名为种类1，编号为YMZ1～YMZ40，掺有不同比例菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油的掺假亚麻籽油分别命名为种类2(C1～C5)、种类3(D1～D5)、种类4(H1～H5)、种类5(K1～K5)、种类6(Y1～Y5)、种类7(Z1～Z5)，利用SPSS 23.0对7类食用油样品的11个甘三酯指标(LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、LLL、OLnO、OLL、OlnP、OOL、OOO、POO)进行判别分析，结果见图3。

由图3可知，判别分析结果与实际情况基本一致，40批纯亚麻籽油与6种掺假亚麻籽油样品能够较好地区分。线性判别方程包括7类食用油及11个指标，方程对应验证结果见表5。40批纯亚麻籽油均被正确识别，掺假亚麻籽油中共有5个样品出现误判，其中当亚麻籽油中掺入菜籽油比例为10%时，被误判为亚麻籽油中掺入花生油；掺入花生油比例为10%时，被误判为纯亚麻籽油；而葵花籽油、玉米油、芝麻油掺入量为10%时，均被误判为亚麻籽油中掺入了大豆油；大豆油与亚麻籽油甘三酯液相色谱特征差别较大，对于亚麻籽油掺入大豆油的情况未出现误判，准确率达100%。因此，判别分析模型可以识别掺入比例为10%及以上的大豆油掺假、20%以上的菜籽油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油的掺假，且准确率达92.9%，说明根据甘三酯组成及含量鉴别亚麻籽油掺伪种类是可行的。

表5 不同类型食用油判别分析结果

图3 典则判别分析

3 结论

亚麻籽油各甘三酯组分在试验条件下得到良好分离，亚麻籽油与用于掺假的6种植物油甘三酯分布情况差异显著，OLnLn、LnLnLn等以亚麻酸为主的不饱和甘三酯是亚麻籽油的主要甘三酯组分。运用亚麻籽油甘三酯对照指纹图谱识别掺假亚麻籽油，当亚麻籽油中掺入植物油比例达10%以上时，可以对纯亚麻籽油与掺假亚麻籽油准确判别。采用判别分析识别掺假亚麻籽油中植物油的种类，在本实验条件下，建立的判别分析模型可以准确识别出掺假植物油的种类，是一种快速、简便的亚麻籽油掺伪鉴定方法