乙型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及验证

年悬悬，周辉，李军英，张家友，杨晓明，3

1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉 430207；3.中国生物技术股份有限公司 北京 100024

流感病毒是一种包膜负链RNA病毒，基因组分段，属于正黏病毒科。目前已知有4型流感病毒（甲、乙、丙、丁型）可引起人类呼吸道疾病［1］。其中，甲型和乙型流感病毒是造成季节性流感流行和疾病负担的主要原因［2-5］。自20世纪80年代末开始，两种在遗传和抗原上截然不同的乙型流感病毒B／Victoria和B／Yamagata系在人类中共循环，且主要的乙型流感病毒流行株在不同年份不同［6］。针对特异性毒株的疫苗接种是预防和控制流感的基本措施，世界卫生组织根据以往流感病毒流行特征，推测下一年流感病毒疫苗株。广泛使用的三价流感疫苗含有A／H1N1、A／H3N2和两种乙型流感疫苗之一（B／Yamagata或B／Victoria系），四价流感疫苗越来越受到重视。因此，预防和控制乙型流感病毒对预防季节性流感的流行具有重要意义。

传统流感病毒的鉴定依赖临床样品的分离以及抗原抗体反应，该方法耗时、繁琐，不适合病毒载量低的样本。荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）作为检测病毒或细胞基因组的一种常见方法，可快速、敏感和特异性地检测目标基因［7-9］，快速、方便地检测乙型流感病毒，并对病毒含量进行定量。PCR或qRTPCR技术用于多种亚型的流感病毒检定，如季节性流感病毒、H5／H9／H13禽流感病毒等［10-16］。

本研究旨在建立一种高灵敏度的乙型流感病毒qRT-PCR检测方法，并对方法进行验证及初步应用。

1 材料与方法

1.1 菌毒株、细胞及鸡胚2018年甲型、乙型流感流行毒株由中国食品药品检定研究院提供；往年的流感疫苗株（H1N1、H3N2、B／Yamagata系和B／Victoria系）购自NIBSC；MDCK细胞、鸡胚及鼠肺适应性流感病毒株由武汉生物制品研究所有限责任公司病研二室提供；感受态大肠埃希菌Top10购自日本TaKaRa公司。

1.2 主要试剂及仪器 质粒小提试剂盒、RNA抽提试剂盒、cDNA合成试剂盒和qPR-PCR酶均购自日本TaKaRa公司；7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 引物、探针的设计及合成 从全球共享流感数据倡议组织（Global Initiative of Sharing All Influenza Data，GISAID）数据库下载不同年份、不同流行地区乙型流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸（neuraminidase，NA）基因序列，使用Snapgene软件进行比对。用DNAMAN和Snapgene软件设计可覆盖B／Yamagata系和B／Victoria系流感病毒HA和NA特定序列的4对正向（F）和反向（R）引物，以及4个分别特异性识别B／Yamagata系和B／Victoria系HA和NA的探针。探针5′端标记发光基团FAM，3′端标记猝灭染料BHQ1，由金斯瑞生物科技有限公司合成。引物和探针的序列及基因组位置见表1。

1.4 标准质粒的构建 将乙型流感病毒目的基因连接至载体PUC57上，由金斯瑞生物科技有限公司完成，重组载体3 162 bp。根据感受态大肠埃希菌Top10感受态操作规则，对重组质粒进行转化、扩增。根据质粒小提试剂盒说明书抽提质粒，光密度法测定质粒浓度，并按下式计算质粒拷贝数。标准质粒图谱见图1。

图1 标准质粒图谱Fig.1 Structure diagram of standard plasmid

式中A为阿伏伽德罗数（6.023×1023），L为质粒长度（核苷酸数），660为核苷酸分子量（g／mol）的近似值。

1.5 样品处理

1.5.1 标准品稀释 根据换算的标准品拷贝数，用PBS稀释为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝数 ／μL。

1.5.2 病毒RNA的提取 根据RNA抽提试剂盒说明书提取病毒RNA，经30 μL无RNA酶水洗脱后，-80℃保存备用。

1.6 qRT-PCR根据cDNA合成试剂盒说明书合成病毒cDNA，使用qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR检测，在qRT-PCR体系中，每个引物和探针的终浓度分别为0.2和0.4 μmol／L。qRT-PCR程序为95℃5 s，60℃30 s，40个循环，设置标准曲线，使用7500实时荧光定量PCR仪进行目的基因的扩增和检测，根据标准曲线CT值和标准质粒的稀释倍数（拷贝数），计算目的基因的拷贝数。所有样本均进行3次独立的重复分析。对qTR-PCR产物进行序列分析。

1.7 方法的验证

1.7.1 线性和范围 标准品用PBS稀释为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝数 ／μL，每个稀释度各200 μL，进行qRT-PCR检测，重复3次。

1.7.2 特异性和灵敏度 取B／Victoria、B／Yamagata、A／H1N1、A／H3N2、A／H5N1和A／H7N9病毒液各200 μL，抽提RNA，反转录为cDNA进行qRT-PCR检测，同时设标准品对照，重复3次。对抽提的BVR-11（B／Victoria，10-7.71CCID50／100 μL）和BVR-1B（B／Yamagata，10-7.13CCID50／100 μL）cDNA 10倍稀释后进行qRT-PCR，检测qRT-PCR（BV-HA、BV-NA、BY-HA和BY-NA）的灵敏度。

1.7.3 精密度 对两种乙型流感病毒样本（BVR-11、BVR-1B）合成的cDNA 10倍稀释后进行qRT-PCR检测，由2名实验员各重复检测3次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），验证该方法的重复性和中间精密度。

1.8 方法的应用 对季节性流感病毒、往年的B／Yamagata和B／Victoria系疫苗株以及在鼠肺传代、MDCK细胞和鸡胚长传代的疫苗株共30份样品进行RNA抽提，反转录合成cDNA，进行qRT-PCR检测。

2 结果

2.1 方法的验证

2.1.1 线性和范围qRT-PCR的扩增曲线和标准曲线见图2和图3，B／Victoria系HA和NA序列的标准曲线方程为Y=-3.318 85 X+40.952，B／Yamagata系HA和NA序列的标准曲线方程为Y=-3.370 1 X+41.061，回归系数（R2）均在0.99以上。线性验证结果符合接受标准，线性范围为10～1×108拷贝数／μL。

图2 B／Victoria系乙型流感病毒qRT-PCR检测方法的扩增曲线和标准曲线Fig.2 Amplification and standard curves of qRT-PCR method for determination of influenza virus B／Victoria strain

图3 B／Yamagata系乙型流感病毒qRT-PCR检测方法的扩增曲线和标准曲线Fig.3 Amplification and standard curves of qRT-PCR method for determination of influenza virus B／Yamagata strain

2.1.2 特异性和灵敏度B／Victoria特异性引物和探针与B／Victoria系特异性反应，B／Yamagata特异性引物和探针与B／Yamagata系特异性反应，对其他型别流感病毒无交叉反应，见表2。灵敏度分析显示，BV-HA、BV-NA、BY-HA和BY-NA qRT-PCR可检测到19.45、13.56、23.45、20.87拷贝 ／μL。结果表明，B／Victoria和B／Yamagata系的HA和NA qRT-PCR检测的病毒含量与Ct值相关性良好（R2＞0.99），且具有较高的灵敏度。

表2 乙型流感病毒qRT-PCR检测方法的特异性分析Tab.2 Specificity of qRT-PCR method for determination of influenza B virus

2.1.3 精密度 试验结果显示，乙型流感病毒qRTPCR检测方法的重复性和中间精密度良好，见表3。

表3 乙型流感病毒qRT-PCR检测方法的重复性和中间精密度分析Tab.3 Reproducibility and intermediate precision of qRT-PCR method for determination of influenza B virus

2.2 方法对临床诊断的适用性30份样品中8份病毒为B／Victoria系，10份为B／Yamagata系，与样品实际结果一致，见表4。

表4 乙型流感病毒qRT-PCR方法检测临床样本的结果Tab.4 Determination results of clinical samples by qRT-PCR for influenza B virus

3 讨论

乙型流感病毒是除了甲型流感病毒之外，导致人群感染流感的主要毒株，因此，对乙型流感病毒进行检测非常重要。本研究建立了一种灵敏度高、重复性好的乙型流感病毒qRT-PCR检测方法，用于乙型流感病毒的检测。

B／Yamagata和B／Victoria系流行病学分布复杂，自2002年以来，B／Yamagata和B／Victoria系在全球范围内共循环，且区域优势持续改变［17-18］。流感病毒的检测方法有病毒培养、血清学检测和核酸检测方法，但检测周期长，qRT-PCR法可在几小时内出结果，灵敏度高。目前，已有一些qRT-PCR方法用于检测乙型流感病毒［19-20］，但随着乙型流感病毒的遗传变化，导致乙型流感病毒的基因组差异增加［21-25］，因此，需针对新乙型流感病毒设计qRTPCR检测引物和探针。本研究建立的qRT-PCR方法针对近年来新出现和流行的分离株的HA序列及NA序列进行引物和探针的设计，覆盖范围广，而且最低检测限可到10个基因拷贝，准确度和精密度较高（R2＞0.99）。此外，重复检测RSD较小，表明该方法具有较高的重复性和可靠性。使用不同型别的流感病毒样本（包括细胞培养、鸡胚培养、鼠肺感染的疫苗株和临床分离样本）验证该方法检测的临床意义，结果表明，该方法能够鉴别多种谱系的乙型流感病毒，且对甲型流感病毒无特异性扩增。qRT-PCR检测方法以标准质粒倍比稀释获得标准曲线，表明该方法不仅可检测出样本中是否含有乙型流感病毒，还可进行定量。但由于样本量受限，本研究无法获得大量的临床样品以评估该方法的临床应用效果，但通过鼠肺感染模型和鸡胚、细胞传代获得的近几年的病毒株对该方法进行了验证，效果良好。随着乙型流感病毒的变异，该qRT-PCR方法可能不会适合新型乙型流感病毒的检测，需要设计新的引物和探针进行病毒的检测。

综上所述，本研究建立了一种更加灵敏、快速的qRTPCR方法用于区分循环的乙型流感病毒B／Yamagata和B／Victoria系，该方法具有良好的特异性和敏感性，对乙型流感病毒的快速诊断具有重要意义。