HPLC法测定益肾续骨片中川续断皂苷VI的含量

周婷婷，梁志云，张俊杰，蒋三元，张健民

（江门市新会区中医院，广东江门 529100）

益肾续骨片为江门市新会区中医院制剂（粤药制字Z20071123），由龙骨、黄芪、续断、煅自然铜、淫羊藿、三七、巴戟天、土鳖虫、当归等十二味中药制成。全方具有养血通经、强壮筋骨、补益肝肾、接骨续筋的功效，主要用于骨折、关节脱位中、后期及肝肾不足诸症。临床应用理想，对于中医院的中医骨伤专科起着关键作用。但该制剂在成品质量控制方面,还是缺少对某些中药指标性成分的测定。为了进一步控制制剂的内在质量，查询到该制剂处方中的主要药材续断在《中国药典》中采用川续断皂苷VI 的量控制药材的质量[1]，在中成药的质量控制中也有以续断皂苷VI 含量为指标的研究报道[2-7]。故本文经由HPLC 来测定分析益肾续骨片中川续断皂苷VI的含量。建立益肾续骨片中续断皂苷VI 的含量测定方法，完善益肾续骨片质量标准资料，能够更好地保证制剂的有效性和安全性。现将结果报告如下：

1 仪器和试药

高效液相色谱仪（岛津LC-20A，日本）；电子天平（HZK-FA210，福州华志科学仪器有限公司）；超纯水器（MILLIPORE，默克）；超声波清洗器（Jeken PS-10，洁康超声波清洗机有限公司）。

川续断皂苷Ⅵ对照品（乐美天医药|德思特生物，批号：DST191126-041,含量：92.3%）；益肾续骨片（江门市新会区中医院制剂，批号分别为：20210826,20211008,20211104），阴性样品（按照益肾续骨片的处方比例和制备工艺，制备不含续断的阴性对照品）；甲醇、乙腈为分析纯，水为纯化水。

2 定量分析

2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-XP 柱（4.6×150 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水溶液（27:73）;检测波长为212 nm;柱温为30℃;流速为1.0 mL/min;进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 准确称定适量川续断皂苷Ⅵ对照品,并置于容量瓶（20mL）内，加入甲醇（MT），实施5min 超声，充分溶解，并定容到20ml，摇匀，得到川续断皂苷Ⅵ对照品液储备液。准确吸量此液1 mL，并移至量瓶（10 mL）内，通过流动相定容到10ml，摇匀，得到川续断皂苷Ⅵ对照品液，质量浓度为89.75 μg/mL。

2.2.2 供试品溶液 准备10片益肾续骨片,将糖衣除掉，借助研钵研细,再过筛（4号）,准确称定2g左右,放到具塞锥形瓶里,准确放入10ml的MT，称定重量,实施0.5h 的超声操作（频率、功率各为40kHz、100W）,待温度下降，进行第2 次称重，加入MT将重量补齐,先摇匀,再滤过。准确量取5ml的续滤液，放到容量瓶（50 mL）里，用流动相定容到50ml，摇匀，用0.45μm 的有机微孔滤膜进行滤过处理，得到供试品液。

2.2.3 阴性对照溶液 根据益肾续骨片的处方比例与配制技术，配制无续断成分的阴性对照品；参考“2.2.2”项所示，制备阴性对照液。

2.3 系统适应性试验考察 于上述色谱设定下，分别精准吸取对照品液、阴性对照液、供试品液。在保留时间与峰型上，供试品和对照品相同，阴性对照未见干扰。具体如图1-3所示。

图1 川续断皂苷VI对照品溶液

图2 供试品溶液

图3 阴性对照溶液

2.4 线性关系考察 精密吸取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液储备液0.4、0.5、1.0、2.0、4.0 mL,分别置于10 mL 量瓶中,用流动相稀释后摇匀，制成浓度分别为35.9、44.875、89.75、179.5、359 μg/mL 的溶液。各对照品液的进样量皆为10μl，根据上述色谱设定实施测定，对于川续断皂苷Ⅵ对照品浓度，通过峰面积开展回归计算,横坐标为进样量X，纵坐标为峰面积Y，经由回归计算确定回归公式：Y=2139X+2612.4，r（相关系数）为0.9999。结果显示，在以上色谱条件下，川续断皂苷Ⅵ处于35.9 至359 μg/mL 范围时,具良好线性。如图4 所示。

图4 川续断皂苷Ⅵ线性关系图

2.5 精密度考察 取浓度为89.75 μg/mL 的川续断皂苷Ⅵ对照品溶液,按照“2.1”的色谱条件,连续进样6 次,进样量为10 μL,测定样品中川续断皂苷Ⅵ的峰面积的RSD 为1.29%，表明仪器精密度良好。见表1。

表1 川续断皂苷Ⅵ对照品精密度

2.6 稳定性考察 取同一益肾续骨片供试品溶液,分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h，按照“2.1”项下条件进样，测定川续断皂苷Ⅵ的峰面积。结果川续断皂苷Ⅵ的RSD 值等于1.60%，可见1 天内供试品液具良好稳定性。如表2所示。

表2 益肾续骨片的稳定性试验

2.7 重复性试验 精密称取同一益肾续骨片样品2 g(批号为20211008),共5 份,按照“2.2.2”项下的方法同法制备成供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定并计算对照品的含量。结果川续断皂苷Ⅵ的含量均值是3.9814 mg/g，RSD 等于1.06%,可见此法具良好重复性，与含量检测要求相符。如表3所示。

表3 益肾续骨片的重复性试验

2.8 回收率试验 分别准确称定适量含量已确定的益肾续骨片（批号“20211008”，含川续断皂苷Ⅵ量是3.9814 mg/g）样品，合计6 份，经由加样回收法，分别准确添加一定量的川续断皂苷Ⅵ对照品，参考含量测定项所示步骤，表4所示为具体结果。

表4 益肾续骨片中川续断皂苷Ⅵ的加样回收率（n=6）

2.9 样品含量测定 检测3 批次益肾续骨片样品中川续断皂苷Ⅵ的含量，下表所示为具体结果。

表5 益肾续骨片中川续断皂苷Ⅵ含量测定结果（n=3）

3 讨论

益肾续骨片是江门市新会区中医院的传统中药制剂，具有养血通经、强壮筋骨、补益肝肾、接骨续筋的功效，主要用于骨折、关节脱位中、后期及肝肾不足诸症,是骨科专科的特色制剂，临床应用反映效果好。续断为此方一大组分，也有“和尚头”之称，是多年生草本植物、川续断科Dipsacus asper Wall.ex Henry（川续断）的干燥根。此药材味苦辛、性微温，归肾经、肝经，作用为止崩漏、补肝肾、续折伤、强筋骨。川续断的成分以生物碱类、三萜皂苷类、挥发油、环烯醚萜类、其它类化合物为主[8]。其中三萜皂苷类是川续断中的主要化学成分，而川续断皂苷Ⅵ为三萜皂苷类中含量最高的成分[9]，川续断皂苷Ⅵ（asperosaponinⅥ）又称木通皂苷D（Akebia saponin D），简称ASD[10]，亦有文献称其为续断皂苷C。李广润等[11]研究表明其药理作用有神经保护作用、心肌保护作用、预防骨质疏松作用、镇痛作用等。因此，在益肾续骨片的制剂过程中，确保续断皂苷Ⅵ的含量的稳定，控制好片剂的质量，对保障益肾续骨片的安全有效，具有实际的临床意义。

益肾续骨片组方药味较多，成分复杂，主要解决益肾续骨片中川续断皂苷VI成分提取分离的适宜方法，能有效的分离续断皂苷VI成分，在含量测定中其他药材成分不产生干扰，真实的测定续断皂苷VI成分含量。参考《中国药典》续断项所示含量测定步骤与相关研究成果[2-7]，0.5h 的超声时间基本可实现充分提取，同时较易操作，最后采用MT 超声法，于0.5h 内完成供试品的制备。参考《中国药典》续断项所示含量测定步骤与相关研究成果[2-7]，通过在200～300 nm 波长范围内的全波段扫描，确定川续断皂苷Ⅵ吸收峰值见于波长212nm 附近，最后明确测定波长为212 nm。实验操作过程中曾按《中国药典》续断项下的含量测定方法：流动相为乙腈（ACN）-水（30:70）进行测定，但由于本方含10种以上的药材，存在较多杂峰，不能实现较好的分离度，经过多次实验测定结果，比较了不同比例的乙腈（ACN）-水系统，最终将流动相确定为乙腈（ACN）-水，且比例为27:73，显示较平基线，较好分离度，良好峰形，川续断皂苷Ⅵ保留时间在21.8min 左右，此时间适宜，同时阴性对照未见干扰。为了使益肾续骨片的质量标准更具完善性，对其临床用药的有效性、安全性施以有效保障，研究发现，通过HPLC 法来测定益肾续骨片内川续断皂苷Ⅵ含量，3 批样品的含量皆≥3.7mg/g，其加样回收率均值等于98.74%，RSD 等于1.26%。此法具较好重复性、精确性，同时结果可靠，在对益肾续骨片内川续断皂苷Ⅵ含量测定与制剂质量控制方面具备应用价值。