饮片提取和配方颗粒调配的仲归颗粒中京尼平苷酸和阿魏酸含量差异研究*

邓杏好，汤钜添，程洁芳，姚远华

（1.佛山市顺德区第三人民医院（佛山市顺德区北滘医院），广东佛山 528311；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东广州 510095）

仲归颗粒来自笔者所在单位临床验方经现代化制剂工艺制备而得，该制剂由杜仲、当归、黄芪等药味经水提后制粒而成，其用于高血压防治或使用降压药后的辅助治疗，通过调节肾功能和血管内皮细胞紧张度等方法，促进患者血压下降。仲归颗粒含有多种化学成分[1-4]，经检索文献和课题相关研究表明，方中所含京尼平苷酸、阿魏酸具有较为显著的iNOS-mRNA 调控活性[5-6]，能够较好地实现前述功效。因此，可以使用上述成分作为评价仲归颗粒质量和功效等关键参数的指标。

中药配方颗粒为中药饮片经现代化、规范化技术提取制备的现代化中药制剂，具有制备工艺先进、质量稳定、提取效率高、使用和携带方便等优势，在多个医疗机构的药学部门均有较为广泛的应用[7-8]。但目前为止，使用配方颗粒直接混合调配和全方饮片煎煮后制粒所得的仲归颗粒是否存在差异，并未进行明确的研究[9-10]。本文拟从两种方法制备的该制剂中京尼平苷酸和阿魏酸的含量着手，基于含量测定结果，研究上述工艺所得成品是否存在明显差异，并根据结果，结合效率、性价比等因素，评价其各自的特点和优劣。

1 仪器、试剂和材料

1.1 仪器设备 含量测定使用Waters2695e 高效液相色谱仪，购自美国Waters 公司，配置为光电二极管阵列（PAD）检测器，柱温箱，自动进样器；对照品、样品称量使用电子精密分析天平购自瑞士Mettler-Toledo 公司；供试品制备用QS-3000 数显温控超声清洗仪购自昆山超声仪器厂。

1.2 试剂、试药和材料 阿魏酸（批号：110773-201915）和京尼平苷酸对照品（批号：111828-201805）购自中国食品药品检定研究院。色谱分析用甲醇、乙腈、磷酸购自德国Sigma-Alderich 公司，试验用超纯水购自Watsons；水煎液制粒法使用的各药味饮片购自广东康美药业股份有限公司；配方颗粒调配法使用的各药味配方颗粒购自广东一方制药股份有限公司。

2 方法和结果

2.1 样品制备 取处方量杜仲、当归、黄芪等仲归颗粒各药味饮片，加30 倍量水提取两次，每次60min，所得煎液合并、滤过，浓缩成稠膏后，加淀粉、糊精等辅料制粒，即得饮片水煎液配制的仲归颗粒；另取同生药量的配方颗粒，过筛混匀，即得配方颗粒调配的仲归颗粒。精密称取上述两种颗粒各约2g，转移至25mL量瓶中，加50%甲醇振摇溶解，继续加入该溶剂定容至刻度，密塞，所得溶液超声处理30min，取出放冷后，加50%甲醇定容至刻度，再使用0.45μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液制备 取京尼平苷酸和阿魏酸对照品，各精密称取约5mg，分别转移至5mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，即得两种对照品含量均为1mg/mL的对照品溶液。

2.3 样品测定方法 参考文献方法并进行适当修改[10]，吸取供试品和对照品溶液，使用色谱柱为Waters XDB C18（柱长250mm，直径4.6mm，粒径5μm），流动相使用乙腈（A）-0.1%磷酸（B），使用梯度洗脱，程序为：0～10min，10%-15%A；10～20min，15%-50%A；20～25min，50%-90%A；25～30min，90%-10%A；后运行10min；流速1.0mL/min，检测波长238nm（0～10min）、316nm（10～30min），柱温25℃，进样量10μL。记录所得色谱图，以及京尼平苷酸和阿魏酸的峰面积，对照品和供试品色谱图见图1。

图1 对照品和供试溶液色谱图（对照品溶液中京尼平苷酸和阿魏酸浓度均为100μg/mL）

2.4 样品测定方法学考察

2.4.1 标准曲线和线性 精密吸取京尼平苷酸和阿魏酸对照品溶液，分别吸取1mL，转移至同一5mL量瓶中，混匀后加甲醇定容至刻度，得两种成分浓度均为200μg/mL 的混合对照品溶液；取上述溶液，逐级稀释，分别制得京尼平苷酸和阿魏酸浓度均为100、50、20、10、5μg/mL 的溶液。吸取上述溶液，使用“2.3”所述HPLC 方法测定京尼平苷酸和阿魏酸峰面积，以该值为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，结果得京尼平苷酸的回归方程为y=7066.1x-4119.3（r2=0.9998），阿魏酸的回归方程为y=14287x+26741（r2=0.9991）。上述结果表明，方法线性良好，能够在5～200μg/mL浓度范围内对京尼平苷酸和阿魏酸进行准确测定。

2.4.2 精密度考察 使用饮片煎液配制的仲归颗粒所制备的供试品溶液（下同），使用“2.3”所述HPLC方法连续测定6次，记录京尼平苷酸和阿魏酸峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示，阿魏酸峰面积的RSD 为0.36%，京尼平苷酸为1.32%；经检索2020 年版《中国药典》，上述数值符合规定，表明方法精密度良好。

2.4.3 重复性考察 按“2.1”所述方法平行制备6份仲归颗粒供试品溶液，使用“2.3”所述HPLC 方法测定，记录京尼平苷酸和阿魏酸峰面积，计算各自含量及其RSD。结果显示，京尼平苷酸为1.37%，阿魏酸含量的RSD 为0.38%；经检索2020年版《中国药典》，上述数值符合规定，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性考察 将供试品溶液放置在自动进样器中，分别在放入后0、2、4、6、8、12h 使用“2.3”所述HPLC 方法测定，记录京尼平苷酸和阿魏酸峰面积，计算各自含量及其RSD。结果显示，京尼平苷酸含量的RSD 为2.36%，阿魏酸为0.20%；经检索2020 年版《中国药典》，上述数值符合规定，表明方法所制备样品在12h内稳定性良好。

2.4.5 回收率测定 取仲归颗粒1g，置于25mL 两瓶中，精密加入对照品溶液适量（加入浓度见表1、表2），继续按“2.1”所述方法制备供试品溶液，再使用“2.3”所述HPLC 方法测定，记录京尼平苷酸和阿魏酸峰面积，计算各自含量、回收率及其RSD。结果显示，京尼平苷酸的平均回收率为99.41%，回收率的RSD 为3.43%；阿魏酸的平均回收率为98.26%，回收率的RSD 为3.22%；经检索2020 年版《中国药典》，上述数值符合规定，表明方法准确度良好。

表1 京尼平苷酸回收率测定结果（n=3）

2.5 两方法样品测定 按“2.1”项下方法分别制备和调配仲归颗粒样品各10 批（详见表3），按“2.3”所述HPLC 方法测定，记录京尼平苷酸和阿魏酸峰面积，计算各自含量。结果显示，10 批饮片煎液制备的仲归颗粒中，京尼平苷酸的含量为0.1758～0.1942mg/g，阿魏酸的含量为0.4036～0.4987mg/g；10批配方颗粒调配的仲归颗粒中，上述两种成分的含量分别为0.1383～0.1894mg/g 和0.3126～0.4650mg/g。

表3 饮片煎液配制和配方颗粒调配的仲归颗粒京尼平苷酸和阿魏酸含量测定结果

2.6 数据处理和统计分析 根据“1.4”项下所得含量测定结果，计算两种方法制备的仲归颗粒的含量，将所得含量数据导入SPSS 24.0 软件中，数据呈现形式为平均值±标准差；对两组数据进行Student-T检验，分别比较各组样品中阿魏酸与京尼平苷酸含量总和的差异；同时，对两个指标性成分也分别进行Student-T 检验，研究单成分组与组之间差异。对两种方法制备的10 批样品进行Student-T检验结果显示，饮片煎液配制法和配方颗粒调配法所得样品中，以每一批样品阿魏酸和京尼平苷酸含量总和计，两种方法所得结果无显著性差异（P＞0.05）；但对两种成分分开检验的结果则显示，两种方法所得样品中阿魏酸和京尼平苷酸的含量均存在显著性差异（P＜0.05）。

3 讨论

根据含量测定结果，可知两种方法制备样品中目标成分的含量无明显差异，但饮片混合煎煮法所得颗粒含量相对较为接近。由“2.2”项下结果可知，单成分比较时，两种方法存在组间显著性差异。其可能的原因是当使用两种指标性成分的加和值进行统计分析时，由于数值增大，数值差异所占比例减小，因此导致T 检验无法得出显著性差异的结果；而当分开计算时，数值相对较小，各组对应样品间差异值占比增加，因此能够发现显著性差异。综合上述结果，可知两种制备方法导致指标性成分差异明显的原因，可能是直接使用配方颗粒混合，所得样品经筛分后不同程度存在损失的情况。同时混合过程中颗粒难以搅拌均匀，导致各批次样品差异较大[7-8]。上述情况在未开发仲归颗粒，该方以配方颗粒配制时也存在。由于调配后由患者自行冲服，受其依从性和相关操作影响，仲归颗粒调配和使用的稳定性、均一性更无法保证。由于使用饮片同时煎煮提取后再将浸膏制粒时，各药味中的活性成分均溶于统一分散系统中，在转移、合并、浓缩过程中，上述成分不易丢失，因此均一性和稳定性较好[9]。

综上所述，虽然从成本和含量等方面分析，配方颗粒直接混合调配仲归颗粒时，与饮片水提液制粒主要指标性成分浓度范围接近，且前者方法更为简便，但从成品质量稳定性的角度考虑，后者仍较为适宜。上述研究结果，除为仲归颗粒的制备工艺提供了科学依据外，进一步证明了该制剂的开发和制备价值。