连翘苷的大鼠血浆药物代谢动力学研究

岑少婷，丘 娜

（1.佛山市三水区妇幼保健院，广东 佛山 528100；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东 广州 510095）

连翘为笔者所在单位多个治疗外感发热、咳嗽的协定方（外感发热药浴方、外感咳嗽药浴方等）中的君药或重要药味，具有清热解毒、消肿散结之功效，可用于治疗或组方治疗感冒发热、呼吸不畅、咽喉肿痛等症[1-3]。根据笔者对本院所用含连翘处方进行调研结果可知，含该药味的处方主治多种疾病，涵盖感冒发热、炎症肿痛、跌打损伤等，连翘的组方、用量仅凭医师经验确定，缺乏科学、准确和既符合中医经典理论又贴近连翘中主要活性成分体内运动过程的依据，因此有必要对连翘及其主要活性成分的吸收、分布、代谢、排泄情况进行深入、全面的研究。

连翘苷为连翘指标性成分，具有较好的抗炎、解热、解毒活性。研究表明，连翘苷A 能够显著降低坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（ⅠL-1β）、白介素-6（ⅠL-6）水平，实现抗炎、修复创伤等功效，并且具有较好的抑菌、抗炎活性[4-5]。因此，在多个研究中，连翘苷均作为评价连翘或含连翘的中药组方、制剂的检测指标之一[6-7]。然而，上述研究多集中在含量测定、成分分析、药理作用研究等领域，对连翘苷在生物体内的运动，尤其是服用连翘水提液后该成分的体内过程仍缺乏系统、深入的研究报告。

1 仪器与材料

1.1 仪器 监测连翘苷使用超高效液相色谱-质谱联用仪（型号：Aquity-UPLC-X-class-Xevo-TQMS），购自美国Waters 公司，配置含四元超高压液相色谱泵、柱温箱和自动进样器、电喷雾离子源（ESⅠ）。其余仪器为5804型低温高速离心机，购自德国Eppendorf 公司；BYN-200-2 型干式氮吹仪，购自上海秉越电子仪器有限公司；电子精密分析天平，购自瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 材料 连翘苷对照品（批号：110821-201816），维拉帕米对照品（批号：100223-200102）均购自中国食品药品检定研究院；血样前处理和UPLC-MS检测用乙腈、甲酸等试剂为色谱纯，购自德国Merck 公司；连翘饮片购自华润三九药业股份有限公司；实验用去离子水为Millipor 净水机制备，仪器购自法国Millipore 公司。实验用SD 大鼠购自广东省实验动物中心（许可证号：SYXK（粤）2018-0067）。

2 方法与结果

2.1 动物实验SD 大鼠给予连翘提取液（相当于20mg/mL 生药量）10mL，口服灌胃给药，服药后分别在0、5min、10min、15min、30min、60min、1.5h、2h、3h、4h、6h、12h、24h 时通过尾缘静脉取血，血样离心取血浆后，保存于预先加入肝素的1.5mL 塑料离心管中，置于-20℃冰箱保存，备用。

2.2 血样前处理方法 取“2.1”项下保存的血浆，精密吸取100μL至干净的1.5mL塑料离心管中，再加入300μL 乙腈，13000 转离心10min，吸取上清液300μL，转移至另一干净的1.5mL 塑料离心管中，氮吹挥去溶剂，再加100μL 内标溶液（浓度为100ng/mL 的维拉帕米甲醇溶液），13000 转离心5min混合均匀，取上清液80μL，作为供试品溶液。

2.3 UPLC-MS 检测条件 使用ESⅠ离子源，选择反应监测模式（MRM），离子传输管温度120℃，氮气流速50L/h，毛细管电压设置为3kV，碰撞气（氩气）流速0.16mL/min，汽化流速650L/h，汽化温度350℃，扫描使用多反应监测模式（MRM），检测离子对为待测物连翘苷623/163，内标维拉帕米455/165，锥孔电压和碰撞电压分别为30V和25V；色谱条件为，色谱柱使用Waters BEH300 C18（50×2.1mm，1.7μm），乙腈（A）-0.1%甲酸（B）为流动相，梯度洗脱程序设定为：0.0～1.0min，5%-10%A；1.0～2.5min，10%-95%A；2.5～3.0min，95%-5%A；其它参数为，流速0.3mL/min，柱温30℃，进样量1μL。血浆标品（即以空白血浆为溶剂的对照品溶液）和实际血样的TⅠC图谱见图1。

图1 连翘苷血浆标品（100ng/mL）和实测血样（1h）的UPLC-MS图谱

2.4 体内分析方法学考察

2.4.1 标准曲线的建立 取连翘苷对照品，精密称取约5mg，置于25mL 量瓶中，加甲醇振摇溶解并加至刻度，配制成浓度为200μg/mL 的对照品溶液。吸取上述溶液适量，与空白血浆适量于1.5mL 塑料离心管中混合均匀，制成连翘苷浓度分别为2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL的血浆标品溶液。吸取该溶液，参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分（连翘苷和内标，下同）的峰面积。以连翘苷和内标的峰面积比为横坐标，对应血药浓度为纵坐标，通过线性回归计算得方程为y=4884.7x-12.617（r2=0.9970），表明测定方法在2～1000ng/mL血药浓度范围内能够准确测定样品中的连翘苷。

2.4.2 灵敏度检测 参考“2.4.1”项下血浆标品溶液的制备方法，平行制得6 份浓度为1ng/mL 的含药血浆溶液。参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积。计算峰面积比、连翘苷血药浓度和回收率及回收率的RSD。 结果得平均回收率为102.23%、RSD为9.06%，表明方法灵敏度良好，能够满足检测要求。

2.4.3 准确度和精密度 参考“2.4.1”项下血浆标品溶液的制备方法，各制备6 份血药浓度分别为5、100、800ng/mL 的含药血浆溶液，参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积。计算峰面积比、连翘苷血药浓度和回收率及回收率的RSD。结果得平均回收率为99.91%～106.89%、RSD 为6.21%～9.47%，表明方法准确度和精密度良好。

2.4.4 血样稳定性 按照“2.4.3”所述的浓度制备含药血浆溶液，分别进行如下处理：（1）含药血浆溶液在25℃室温下放置8h 后，参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积，所得结果用以考察样品的常温稳定性；（2）含药血浆溶液参照“2.2”所述方法制成供试品溶液后，放置在UPLC-MS 的自动进样器中（温度设定为4℃），2h 后参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积，所得结果用以考察样品的进样稳定性；（3）含药血浆溶液冻存于-20℃后，取出融解，重复上述操作3 次，之后参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积，所得结果用以考察样品的冻融稳定性；（4）含药血浆溶液冻存于-20℃，30 天后取出融解，之后参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积，所得结果用以考察样品的长期保存稳定性。上述各考察项均为三个浓度每个浓度平行制备6份样品。根据测定结果计算峰面积比、连翘苷血药浓度和回收率及回收率的RSD。结果得平均回收率为93.881%～103.91%、RSD 为4.80%～12.67%，表明方法稳定性良好。

2.4.5 基质效应 分别考察血浆和溶剂的基质效应对样品测定的影响。血浆基质效应考察的方法为：取空白血浆100μL，放置于1.5mL 塑料离心管中，参照“2.2”所述方法处理至“氮气吹干”，加对照品溶液（甲醇配制，浓度同“2.4.3”项下的含药血浆溶液，同时含100ng/mL 内标）100μL，每个浓度分别配制6 份，离心5min，取上清液80μL，参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积；溶剂基质效应的考察方法为，取连翘苷对照品溶液，加甲醇稀释配置成浓度为5、100、800ng/mL的溶液，参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积。根据测定结果计算峰面积比、连翘苷血药浓度和回收率及回收率的RSD。结果得平均回收率为94.29%～103.33%、RSD为6.26%～11.86%，表明样品和溶剂基质对测定无明显影响。

2.5 血药浓度测定和药动学参数计算 取“2.1”项下所得血浆样品，参照“2.2”所述方法制成供试品溶液，并继续参照“2.3”所述方法测定待测成分的峰面积。根据测定结果计算峰面积比、连翘苷血药浓度。根据所得结果绘制血药浓度-时间曲线，同时将数据导入DAS2.1 软件计算药动学参数。结果求得，Tmax=1.00h，Cmax=111.5519ng/mL，T1/2=1.801，MRT=2.905h，AUC0～i=256.217 ng/mL·h，AUC0～∞=291.336 ng/mL·h。上述结果表明（见图2），大鼠口服连翘苷后，吸收速度较快，最大血药浓度和体内驻留时间、代谢速率适中。

图2 连翘苷血药浓度-时间曲线（n=6）

3 讨论

根据血药浓度-时间曲线和药代动力学参数可知，连翘苷口服吸收较好，在体内浓度适宜，能够达到足够发挥疗效的峰浓度和蓄积量；同时，连翘苷的消除半衰期和平均驻留时间较为合适，表明该成分在口服吸收后不易被快速代谢和消除，能够持续在体内发挥作用。同时，上述结果也表明，连翘水提液能够较好地将连翘苷从药材饮片中提取出来，为证明中药汤剂的有效性及研究与连翘相关的功效物质基础提供了科学研究和数据支撑。

连翘性凉味苦，归心、肝、胆经，具有“轻清宣散，偏于清透上半身之邪”的作用特点。李莉等[8]对连翘中主要活性成分进行的组织分布研究表明，连翘苷在服药2h 后于肾脏中达到极值，且该成分主要分布于肾脏，在其他组织中分布相差不大。本文中药动学参数显示，连翘苷的Tmax=1.00h，T1/2=1.801，MRT=2.905h，可与前述文献报道相对应，表明连翘提取物经口服后，连翘苷相对快速地进入体循环中，集中于肾脏发挥治疗作用并代谢。上述结果进一步印证了中医组方和连翘应用的合理性，为更加精准地指导临床开具处方提供了科学依据。

UPLC-MS 测定条件优化方面，原先打算采用柱长为100mm（内径、粒径、填料材质等其余参数相同）的BEH 色谱柱，但在实际使用中发现该色谱柱中的连翘苷洗脱时间较长（约2min），拖慢了整体分析效率；如提升流速则导致柱压过高，损坏色谱柱。因此，本实验选择50mm 短柱作为固定相，由于连翘苷和内标的检测离子对不存在重叠，无需使用色谱方法将其分开，使用短柱时各目标峰的峰型和分离度均符合精准测定的要求，同时洗脱时间缩短，分离效率提高，结合文献报道的测定方法[9]，因此决定采用短柱。