Herpud1在盆底肌萎缩模型中的表达研究

肖雅，洪莉，闵洁，汤剑明，李素廷，陈茂，黄筱雨

女性盆底功能障碍(pelvic floor dysfunction，PFD)是由于盆底支持组织薄弱而引起的一系列病症，包括压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)、盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)、肛门失禁、下尿路感觉异常、排便功能障碍以及与盆腔器官相关的慢性疼痛综合征等[1]。阴道分娩和衰老是PFD的重要危险因素，据统计，50%的产妇有不同程度的SUI和POP，且发病率随着年龄的增长而增加[2]。已有研究表明，阴道分娩可能通过损害骨盆支持组织，如肌肉、结缔组织和神经结构，导致PFD[3]。经阴道分娩后，POP、SUI和膀胱过度活动症的累积发生率与盆腔肌肉力量相关[4]。本团队前期研究发现多次阴道分娩小鼠盆底肌中T 型钙离子通道(TH)编码基因CACNA1H特异性降低，敲除小鼠CACNA1H基因(Cacna1h-/-)后出现多部位肌肉萎缩和肌肉功能下降，内质网应激 (endoplasmic reticulum stress，ERS) 激活。 ERS可能是该疾病潜在的治疗靶点[5]。

未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)是一种细胞应激反应系统，当未折叠或错误折叠的蛋白在内质网的管腔内积聚时被激活，从而导致ERS[6]。这一机制的最终目标是通过减少蛋白质翻译、增加蛋白质降解和提高内质网折叠能力来恢复细胞内稳态。越来越多的证据表明，这一过程与肌肉萎缩的调节有关，而参与UPR的各种因素也被证明促进了肌肉萎缩[7]。同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白(Herpud1)是一种54 kDa的跨膜蛋白，定位于ER膜上，是一种应激反应蛋白[8]。早期研究证明Herpud1在维持内质网钙稳态和调节线粒体功能方面起着重要作用[9]。Herpud1的诱导不仅提高了内质网的折叠能力，减轻了蛋白质超载，还参与了内质网相关降解(ER-associated degradation，ERAD)多蛋白复合物的形成，有助于稳定复合物并促进未折叠蛋白的有效降解，可以阻止ERS引发的细胞凋亡[9-10]。Herpud1在应激条件下通过稳定依赖于三磷酸肌醇受体(IP3R)的Ca2+信号来保护细胞免于死亡[11]。Nogalska A等[12]的研究表明Herpud1在散发性包涵体肌炎中的诱导可以作为一种代偿机制，以改善受影响肌肉纤维的内质网功能；敲除Herpud1的小鼠表现出对葡萄糖负荷的不耐受，并且降低了胰岛素依赖性葡萄糖摄取、GLUT4 易位至质膜[13]，这可能与肌肉的萎缩相关。综上，Herpud1可能通过提高骨骼肌在应激环境下的耐受能力来保护肌纤维免受损伤，目前尚无Herpud1在PFD发病机制中的相关研究。本研究旨在探讨Herpud1在盆底肌萎缩模型与正常小鼠中的表达差异，为进一步探究其在PFD发病机制中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 小鼠的饲养和实验按照武汉大学的机构指南和规定进行。所有涉及动物的操作均经武汉大学人民医院机构动物保护利用委员会批准。野生型雌性C57BL/6J小鼠(WT组)购自武汉大学动物实验中心，Cacna1h-/-小鼠(TH-null组)购自杰克逊实验室(Stock 013770；Bar Harbor,ME,USA)。分别各取10只4月龄未生产过的两种类型小鼠，体重20～23 g，平均(21.5±1.5) g。两组小鼠的周龄及体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.1.2 实验细胞及处理 小鼠C2C12成肌细胞购自南京科佰生物科技有限公司。C2C12小鼠成肌细胞增殖培养采用高糖(4.5 g /L) (DMEM)生长培养基(GM)，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。当细胞密度达90%左右时转入分化培养基(DMEM+2%马血清，1%青霉素-链霉素)培养4 d，NNC 55-0396(Sigma-Aldrich)干预24 h、48 h。

1.1.3 主要试剂和仪器 抗Herpud1抗体(Abcam)；免疫组化试剂盒、肌肉组织固定液(武汉赛维尔生物科技有限公司)；BCA 蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；蛋白上缓冲液(谷歌生物技术有限公司)；正置荧光显微镜(日本，Olympus)；ChemiDoc成像系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.)；尿动力学检查仪为Power lab 多导电生理记录仪；微量注射泵(长沙健源医疗科技有限公司，JZB-1800D 型)。

1.2 方法

1.2.1 尿动力学检测 采用1.5%异氟烷对小鼠进行气体麻醉后取仰卧位固定。将小儿留置针去除针芯，注射生理盐水排气，丁卡因胶浆润滑表面后行小鼠导尿。导尿手法为:一手拿显微镊，钳夹尿道外口，向上提起以绷直尿道，另一手拿留置针轻轻插入尿道，进针约1～1.2 cm。导尿成功后，空针抽吸排空小鼠膀胱，连接延长管及三通，三通外接测压管和微量注射泵。管道连接成功后体内置零，然后开启微量注射泵向膀胱内灌注生理盐水，泵水速度为 1 mL/h。观察膀胱压力变化，同时检查小鼠有无尿液溢出，此时的压力为膀胱漏尿点压(bladder leak point pressures，BLPP)。以尿道口出现第1滴液体为准，记录当时的膀胱容量和膀胱内压分别为最大膀胱容量(MBC)和BLPP。重复上述实验 3 次。检测完毕后，用碘伏消毒尿道外口。

1.2.2 盆底肌取材 采用断椎法处死小鼠后，打开盆腔，暴露盆底，分离筋膜与脂肪组织，取盆底肛提肌组织沿中线分成两块，约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，反复、多次用生理盐水冲洗，一块采用肌肉固定液固定标本，常规石蜡包埋、切片;另一块快速放入-80℃冰箱中低温保存。

1.2.3 免疫组织化学染色 按免疫组化试剂盒说明进行相关操作。切片在 60℃ 加热 30 min 抗原修复，用分级醇系脱蜡再水化，一抗按照1∶100 比例稀释。光镜下观察，细胞浆或胞膜中有棕色颗粒为阳性表达。免疫活性用积分光密度(IOD)值量化，平均密度用ImagePro Plus 6.0版本软件通过高分辨摄取图像信号，测定灰度值，用平均灰度值表示Herpud1蛋白的表达强弱，平均密度=IOD/面积。

1.2.4 Western blot检测 取小鼠盆底肌组织液氮研磨后加入蛋白裂解液，充分混匀后4℃、12 000 r /min离心5 min，取上清，采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测样品的蛋白浓度，加入适量5×蛋白上样缓冲液后煮沸8 min使蛋白变性，使用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样本，然后将凝胶上分离的蛋白电转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗Herpud1抗体(1∶3 000稀释)4℃孵育过夜，PBS漂洗3遍后，二抗室温孵1h，再次PBS漂洗3遍。用增强的化学发光底物处理免疫反应带，并使用ChemiDoc成像系统进行分析，实验独立重复3次以上。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组小鼠尿动力学检测结果

盆底肌肉支撑膀胱或尿道并控制膀胱颈过度活动，盆底肌薄弱或受损可能导致SUI[14-15]。因此，我们检测了野生型和盆底肌萎缩模型小鼠的尿动力学，可用来间接评估盆底肌功能。尿动力学检测显示：与WT组相比，TH-null组小鼠的BLPP值显著降低，差异有统计学意义(P<0.0001)；MBC测定显示，与WT组相比，TH-null组的MBC值显著降低，差异具有统计学意义(P<0.0001)。这提示T型钙通道敲除小鼠(TH-null)出现盆底肌支持功能下降。详见表1和图1。

注：A：MBC统计分析；B ：BLPP统计分析(****与WT组比较，P<0.0001)。

表1 两组小鼠尿动力学检测值

2.2 两组小鼠盆底肌中Herpud1蛋白水平表达情况

Western-blot检测结果显示，TH-null组小鼠较WT组Herpud1表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见下页图2A和2B。免疫组化结果显示，与前期研究结果一致[14-15]，通过显微镜观察可见到TH-null组肌纤维面积较WT组小鼠更细小，且TH-null组免疫化学活性也同样明显低于WT组，差异有统计学意义(P<0.05)，见下页图2C和2D。

2.3 NNC处理后Herpud1表达变化

本团队前期研究表明T型钙离子通道抑制剂NNC处理以时间和浓度梯度的方式促进C2C12细胞的肌管萎缩与凋亡[5]。具体表现为MYHC免疫荧光染色肌管数目变少，直径变小，萎缩相关指标表达增高。因此接下来，本研究中C2C12分化4 d后予以NNC处理24 h和48 h，检测细胞Herpud1蛋白表达水平变化。结果显示NNC以时间梯度的方式抑制Herpud1的表达。见图3。

3 讨论

PFD是一组普遍且令人痛苦的疾病，它导致膀胱、子宫阴道穹窿和直肠异常下降，包括尿失禁、大便失禁和POP等。作为老年女性的一个主要健康问题，POP和尿失禁接受单次手术的终生风险为11.1%，并且再次手术的比例很大[16]。PFD的生理病理机制复杂，有许多危险因素，其中妊娠和阴道分娩作为PFD发生发展的重要发病因素已经得到了广泛的证明[17-18]。随着人口老龄化以及“二孩”、“三孩”政策的开放，PFD在我国的发病率必然呈增高的趋势，因此探究PFD的发病机制对于疾病的防治具有重大意义。

盆底肌在盆底支撑中起关键作用，肛提肌作为盆底肌肉中最大、最重要的肌群，在肌肉纤维方向承受了盆底最大的压力[19]。妊娠时子宫因重力下移，比未妊娠时更大的力量直接作用于肛提肌等支持系统，肛提肌等在向下的压力作用下而被拉伸，盆底肌肉长时间过度伸展，甚至超出神经纤维牵张极限而失去神经支配。分娩过程中，胎头、胎臀娩出时，盆底肌承受极限牵拉甚至出现撕脱，对盆底肌造成严重的机械损伤[20]，这种损伤可能是多次分娩相关的机械损伤引起盆底肌功能缺陷的主要因素。本研究团队前期研究中发现，多次分娩后小鼠盆底肌肌纤维直径下降，肌力减退，CACNA1H的表达特异性降低。本文首先通过模拟人体尿道置管检测TH-null小鼠尿动力变化，发现TH-null小鼠的BLPP、MVB均较WT组相比明显降低，也进一步证明TH-null小鼠可以做为PFD的动物模型。与此同时，前期研究发现TH-null小鼠中存在ERS激活和自噬抑制，而ERS抑制剂可以减轻T通道抑制剂引起的损伤和自噬抑制从而成为可能的治疗靶点[5]，且ERS引起细胞内钙离子稳态失衡，进而引起线粒体相关凋亡发生[21]。研究表明ERS的过度激活会介导骨骼肌萎缩[22]。Herpud1分子被认为是ERS损伤中的调节分子，Herpud1在维持内质网钙稳态和调节线粒体功能方面起着重要作用。本研究结果显示，在TH-null小鼠和NNC诱导的成肌细胞肌管萎缩模型中，Herpud1表达水平均明显下降(见图2和图3)，由此可推测CACNA1H的敲除或抑制引起的Herpud1表达下降，从而使ERS过度激活，细胞内钙离子失衡，进而引发细胞凋亡和盆底肌萎缩。

注：A.小鼠盆底肌Herpud1蛋白的 Western-blot分析条带；B.小鼠盆底肌Herpud1蛋白的Western-blot定量分析(****与WT组比较，P<0.0001)；C和D.小鼠盆底肌免疫组织化学染色和定量分析(***与WT组比较，P<0.001)。

注：A.C2C12不同处理组中Herpud1蛋白的 Western-blot分析条带；B.C2C12不同处理组中Herpud1蛋白的 Western-blot定量分析(***与WT组比较，P<0.001)。

本研究存在一定的局限性，由于缺乏人体组织研究和基因层面对Herpud1表达进行干预，本研究仅初步证实Herpud1在盆底肌萎缩模型中表达下降，可能参与盆底肌萎缩过程，仍需进一步研究证实。