HR-HPV感染聚焦超声治疗前后阴道微生态分析

陶华，傅锦坚，柳涵之，马靖文，黄以吉*

女性阴道微生态系统是一个由微生态菌群、局部免疫以及特殊的解剖结构共同构成的，与宿主、环境之间相互制约、相互协调、动态平衡的体系。阴道微生态体系一旦失衡，可能增加感染阴道炎、发生宫颈癌和艾滋病的风险[1]。高危型人乳头瘤样病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)感染是宫颈癌的“元凶”，HR-HPV感染宫颈上皮细胞后需要进行定植、基因重组后才能发展为宫颈上皮内病变，而80%以上的妇女均能依靠自身免疫力将其清除[2-3]。因此，HR-HPV的定植条件成为近年来的研究热点。随着分子生物学的发展，多项研究揭示阴道微生态情况与HR-HPV感染及预后密切相关，HR-HPV感染可加重患者阴道微生态紊乱程度，降低宫颈局部细胞免疫功能，从而加快疾病发展[4-5]。

目前治疗持续性HR-HPV感染常用方法有药物及物理治疗，其中药物方面除了干扰素，目前还没有其他药物得到临床试验验证[6]。物理治疗方面，聚焦超声(focused ultrasound，FUS)治疗技术是一种全新、无创的超声波局部物理治疗手段。超声能量透过表层组织聚集于特定深度的靶区组织，可瞬间导致细胞膜失去连续性、病变组织变性坏死。同时，FUS治疗能改善宫颈局部微循环，增加局部氧供，发挥其组织修复及治疗病变的作用[7]。但相关研究同时发现，在同样的超声治疗条件下,不同患者预后有着明显差异，而找出造成治疗预后差异的原因将对提高FUS治疗HR-HPV感染患者的有效率起到积极作用。阴道微生态有可能是影响FUS治疗HR-HPV感染患者预后的重要因素之一，但目前国内外缺少此类研究报道[3]。本研究为探析FUS治疗是否能够改善HR-HPV感染患者的阴道微生态状况，从而阻断HR-HPV持续性感染，为治疗HR-HPV感染及预防其病变进一步发展提供新型治疗模式。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2020年7月至2021年7月在柳州市妇幼保健院就诊的120例18～45岁的育龄期HR-HPV感染患者作为研究对象。入组标准为暂时无生育计划并排除妊娠，HR-HPV检测阳性持续6个月以上，经阴道镜下活检，病理结果为低级别宫颈上皮内瘤变(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)以下的妇女。征得患者同意，签署手术同意书后予行FUS治疗，分别收集术前及术后3个月的阴道分泌物进行检测和对比。

1.2 方法

1.2.1 采集标本 协助患者取膀胱截石位,经常规清洁与消毒。处理后,通过窥阴器充分暴露患者阴道,宫颈口等部位,将棉拭子在患者宫颈口旋转3圈,刮取分泌物,然后浸入保存液,放置在-80℃低温条件下保存,等待HR-HPV检测；利用棉拭子刮取患者阴道内侧的分泌物,妥善保存在无菌试管中,等待阴道微生态检测。

1.2.2 阴道微生态检测

1.2.2.1 盐水湿片显微镜镜检 ① 制片：将1份采集的阴道分泌物标本直接均匀涂在滴有生理盐水的玻片上。② 镜检：低倍镜下观察有无滴虫、假丝酵母菌菌丝等；高倍镜下观察白细胞、上皮细胞、杆菌、球菌的数量，寻找有无假丝酵母菌菌体及孢子。

1.2.2.2 Comet-800阴道微生态检测分析系统检测 取第2份阴道分泌物标本上机进行阴道微生态检测。检测分为两个部分：① 干化学，检测过氧化氢酶、白细胞脂酶、唾液酸苷酶和pH值；② 革兰染色，阴道分泌物标本涂片后干燥固定，革兰染色后使用该系统在油镜下检测标本的菌群情况，包括乳酸杆菌比例、菌群密集度、菌群多样性及Nagent评分，并对该标本的微生态状况进行评价。

1.2.3 评判标准 (1)阴道微生态平衡：乳酸杆菌比例≥70%；其他杂菌<30%；pH值3.8～4.5；Nagent评分0～3分；白细胞个数0～10个/高倍镜视野且无脓细胞及其他特殊病原体；白细胞脂酶、唾液酸苷酶阴性；过氧化氢酶阳性。(2)阴道微生态失衡：观察或检测到线索细胞或白细胞脂酶、唾液酸苷酶阳性且Nagent评分≥7分，判定为细菌性阴道炎；观察或检测到假丝酵母菌菌丝、菌体或孢子，判定为霉菌性阴道炎；观察或检测到阴道毛滴虫，判定为滴虫性阴道炎；优势菌非乳杆菌提示为菌群失调；无优势菌，菌群密集度≤1个“+”,多样性≤1个“+”提示菌群抑制；以乳杆菌为优势菌，菌群密集度3～4个“+”,多样性3～4个“+”提示菌群增殖过度。

1.2.4 HR-HPV检测 使用荧光探针杂交捕获技术与DNA检测试剂盒进行HR-HPV检测，检测时的基因型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。

1.2.5 聚焦超声治疗 FUS系统(型号:CZF300,生产厂家:重庆海扶医疗科技股份有限公司),依据病变范围设置治疗参数,治疗功率3.5 W，执笔式握住超声治疗枪手柄,以宫颈口为中心,紧贴宫颈内口从里向外进行环形扫描,扫描速率为5～10 mm/s,扫描至超出病变边缘5 mm 位置为宜；第2次以逆时针顺序从内向外扫描整个病变区,重复扫描2～3次,至整个治疗区可见明显变白及塌陷。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 术前和术后阴道微生态平衡情况比较

术前共检出69例阴道微生态失调,占57.5%；术后3个月共检出9例阴道微生态失调,占7.5%。术后3个月阴道微生态失调占比低于术前,差异有统计学意义(P<0.01)，详见表1及表2。

表1 术前及术后3个月阴道菌群密集度比较

表2 术前及术后3个月阴道菌群多样性对比

2.2 术前和术后阴道分泌物异常情况比较

术后3个月H2O2阴性率、白细胞酯酶阳性率、唾液酸酐酶阳性率、细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎阳性率、HR-HPV阳性率均低于术前,差异均有统计学意义(P<0.05)，详见下页表3。

表3 术前及术后3个月阴道分泌物异常情况比较[例(%)]

2.3 术前和术后阴道微环境异常情况比较

术后3个月pH值、Nagent评分水平均低于术前,差异均有统计学意义(P<0.01)，详见下页表4。

表4 术前及术后3个月阴道微环境异常情况比较

3 讨论

女性阴道的菌群相对单一，其中乳酸杆菌为维持阴道正常微生态的优势菌，有助于抑制致病微生物的入侵及生殖道肿瘤的发生，并可激活宫颈局部免疫系统，及时清除致病微生物，但有研究发现HR-HPV感染者菌群多样性增加[8]，与本研究结果一致。此外，多项回顾性研究通过对比HR-HPV阳性者及阴性者的阴道微生态状况，得出阴道微生态失衡与HR-HPV持续性感染密切相关。刘莹等[9-10]研究发现HR-HPV感染的LSIL患者合并BV感染时，尽早纠正微生态失衡可能会缩短HPV感染病程，加速其消退，本研究结果与之一致。

FUS治疗HR-HPV感染及低度宫颈上皮内瘤样病变为我国首创，其安全性及有效性已得到证实[11]。本研究结果显示,120例HR-HPV感染的妇女经FUS治疗后3个月，阴道微生态平衡情况各项指标均优于术前，差异有统计意义；细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎及HR-HPV阳性率占比均明显低于术前,差异有统计意义；阴道微环境改善情况明显优于术前,pH值及Nagent评分均低于术前,差异有统计学意义。说明FUS治疗后，HR-HPV患者的阴道微环境会得到明显改善。分析原因也许与FUS治疗后宫颈局部的血管重建，血运情况发生变化,以及坏死的感染细胞碎片刺激免疫细胞增殖,激活了T淋巴细胞免疫调节,继而改善局部微环境有关，需要后期进行进一步的免疫机制研究证实。

综上所述,经FUS治疗后,HR-HPV阳性患者的阴道微生态情况可得到明显改善,从而缩短HR-HPV转阴的时间,降低宫颈病变的进展风险，值得临床推广应用。